氨基酸含量的測定及分離鑒定

1、實驗七 氨基酸的分離鑒定紙層析法 一 目的 通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法二 原理 紙層析法是利用各物質(zhì)不同的分配系數(shù)，使混合物隨流動相時而得 到分離的方法。 紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的。濾紙纖維與水親和力較強(qiáng)，而與有機(jī)溶劑親和力弱，所以紙層析以濾紙纖維和結(jié)合水為固定相，以有機(jī)溶劑為流動相。當(dāng)有機(jī)相沿濾紙流動經(jīng)過樣品點時，樣品點上的溶液在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，樣品移動速率與樣品的極性及水親和力有關(guān)，因此，極性氨基酸移動較慢，而非極性氨基酸移動較快。 物質(zhì)被分離后在紙層析圖上的位置用Rf值表示 Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿距離 在一定條件下某種物質(zhì)的

2、Rf值是常數(shù) 溶液前沿層析點 原點 溶劑前沿 苯丙氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 1器材 1 層析缸 2 毛細(xì)管 3 噴霧器 4 培養(yǎng)皿 5 層析濾紙4操作步驟 1 取層析濾紙一張，在紙的一端距邊緣2-3處用鉛筆劃一條直 線，在直線上約每隔3-4做一次記號，共記四次。 2 用毛細(xì)管將各種氨基酸樣品分別點在4個記號點上，干后再點 一次。盡量點成圓形，并在各點表上樣品名。 3 手通過紙將濾紙卷成圓筒形，并用針縫，共3針。每縫一針打 個結(jié)，第三針的線留長一點。 4 將縫好的紙（裝入）垂直放入裝有擴(kuò)展劑的層析缸內(nèi)（點樣的 一端朝下，濾紙不應(yīng)碰到缸壁） 5 約2個小時后，將濾紙取出，拆掉線后，放入烘干機(jī)內(nèi)烘干，

3、約10分 鐘后取出即顯色。 6 畫出溶液前沿線，確立個層析點中心，計算各氨基酸的Rf值 實驗結(jié)果: 丙氨酸苯丙氨酸天冬氨酸 L/d/Rf原點到溶劑前沿距離為L，原點到層析點中心距離為d 氨基酸的定量分析 甲醛滴定法一、目的： 初步掌握甲醛滴定法測定氨基酸含量的原理和操作要點 水溶液中的氨基酸為兼性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。甲醛可與氨基酸上的N+H3結(jié)合，形成NHCH2OH、N(CH2OH)2 等羥甲基衍生物，使N+H3上的H+游離出來，這樣就可以用堿滴定N+H3放出H+，測出氨基氮，從而計算氨基酸的含量。二、實驗原理若樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結(jié)果算出氨基酸的

4、含量。若樣品中含有多種氨基酸（如蛋白質(zhì)水解液），測不能由此法算出氨基酸的含量。脯氨酸與甲醛作用后，生成的化合物不穩(wěn)定，導(dǎo)致滴定后結(jié)果偏低；酪氨酸含酚基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致滴定結(jié)果偏高。 三、材料、試劑與器具（一）試劑1、0.5%酚酞酒精溶液 稱0.5g酚酞溶于100ml50%酒精中。2、0.1mol/L甘氨酸溶液 取3.75g甘氨酸溶于500ml蒸餾水。3、標(biāo)準(zhǔn)0.0200mol/L 氫氧化鈉溶液4、中性甲醛溶液 取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示劑約3ml，滴加0.01mol/LNaOH溶液， 使溶液呈微紅色，臨用前中和。（二）實驗器具 錐形瓶 、堿式滴定管、移液管洗耳球、天平 容量瓶、試劑瓶、量

5、筒、玻棒與燒杯四、操作步驟 1、取5只50ml錐形瓶，按下表加入試劑。 錐形瓶編號 試劑123450.1mol/L甘氨酸溶液/mL01100中性甲醛溶液/mL11111水/mL322220.5%酚酞酒精溶液（滴）44444未知濃度的氨基酸混合溶液/mL000112、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液變微紅色 注意：滴定管中溶液的初始位置和滴定結(jié)束時的位置； 滴定管的使用方法3、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液變微紅色4、記錄每次滴定所用的0.0200mol/L NaOH溶液的 體積五、計算標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸氨基氮的回收率=VNaoH*0.0200mol/L理論計算值*14.008理論計算值:取用氨基酸的體積乘以濃度,再乘以14.008VNaoH 兩次測定所用氨基酸的體積的平均值每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克數(shù)為式中：V1為滴定樣品消耗氫氧化鈉的體積（ml）； V2為滴空白消耗氫氧化鈉的體積（ml）； MNaOH 標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的摩爾濃度1、甲