人源化單克隆抗體的構(gòu)建技術(shù)

1、人源化單克隆抗體的構(gòu)建技術(shù)摘要：?jiǎn)慰寺】贵w從問世到現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于臨床， 經(jīng)歷了一段曲折的發(fā)展歷程。 其中 人源化抗體是一個(gè)重要的里程碑，并伴隨著一系列重大的技術(shù)革新，如 PCR 技術(shù)、抗 體庫技術(shù)、 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。 抗體技術(shù)從最初的嵌合抗體、 改型抗體逐漸發(fā)展為今天的人 源化抗體。本文綜述了人源化單克隆抗體的構(gòu)建技術(shù)。關(guān)鍵詞： 人源化，單克隆抗體，構(gòu)建從20世紀(jì)70年代英國學(xué)者M(jìn)ilstein和德國學(xué)者Kohler利用細(xì)胞融合技術(shù)首次成功地 制備出單克隆抗體以來 1，單克隆抗體在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多學(xué)科中發(fā)揮了巨 大的作用。 單克隆抗體可用于分析抗原的細(xì)微結(jié)構(gòu)及檢驗(yàn)抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)

2、系，還可用于分離、純化特定分子抗原，甚至用于臨床疾病的診斷和治療等。然而，單克隆抗 體技術(shù)在臨床治療應(yīng)用中的進(jìn)展卻很慢，主要原因是目前單克隆抗體大多是鼠源性的， 而鼠源性單克隆抗體應(yīng)用于人體治療時(shí)存在諸多問題： 一是不能有效地激活人體中補(bǔ)體 和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human antigen mouse antibody， HAMA) ；三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。因此，在保持對(duì)特異 性抗原表位高親和力的基礎(chǔ)上進(jìn)行人源化改造， 減少異源抗體的免疫原性， 成為單克隆 抗體研究的重點(diǎn)。隨著對(duì)抗體基因的研究和DNA分子重組技術(shù)的應(yīng)用，通過基因改造 獲

3、得特異性抗體成為可能。1989年 Huse等首次構(gòu)建了抗體基因庫，從而使抗體的研究從 細(xì)胞水平進(jìn)入到分子水平，并推動(dòng)了第 3代抗體基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展。至此，抗 體的產(chǎn)生技術(shù)經(jīng)歷了三個(gè)階段： 經(jīng)典免疫方法產(chǎn)生的異源多克隆抗體； 細(xì)胞工程產(chǎn)生的 鼠源單克隆抗體及基因工程產(chǎn)生的人源單克隆抗體。人源化抗體就是指抗體的可變區(qū)部分(即 Vh 和 Vl 區(qū))或抗體全部由人類抗體基 因所編碼。 人源化抗體可以大大減少異源抗體對(duì)人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)。 人源化抗 體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發(fā)展為今天的人源化抗體。1 嵌合抗體的構(gòu)建抗體分子與抗原結(jié)合特異性由 L 鏈和 H 鏈 V 區(qū)決定，抗

4、體 C 區(qū)可作為異源蛋白誘 發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗小鼠抗體( human anti-mouse antibody， HAMA )。將小鼠單克隆 抗體C區(qū)用人抗體C區(qū)代替而拼接成嵌合抗體(chimeric antibody)，這樣表達(dá)的抗體分 子中輕重鏈的 V 區(qū)是異源的，而 C 區(qū)是人源的，這樣整個(gè)抗體分子的近 2/3 部分都是 人源的。這樣產(chǎn)生的抗體， 減少了異源性抗體的免疫原性， 同時(shí)保留了親本抗體特異性 結(jié)合抗原的能力。嵌合抗體(chimeric antibody)屬第一代人源化抗體，有 60%70%的人源區(qū)域，是 目前研究較多也較為成熟的基因工程抗體，人鼠嵌合抗體基因工程改造策略主要包 括

5、：(1)從鼠雜交瘤中克隆V區(qū)基因。(2)選擇合適的人C區(qū)基因。(3)構(gòu)建載體 并在一定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)根據(jù)嵌合抗體 H 鏈和 L 鏈基因是否克隆、表達(dá)與同一載體與 否，可將基因工程嵌合抗體的表達(dá)分為共轉(zhuǎn)染表達(dá)模式(co-tra nsfecti on model)和單載體轉(zhuǎn)染表達(dá)模式(single vector transfection model)。根據(jù)所需達(dá)到的功能，人重鏈的恒定區(qū) 可為 IgA、IgD、IgE、IgG 或 IgM 中的一種。 通常，人源抗體包括嵌合抗體常采用 IgG， 因其對(duì)不同的亞基都合適。1986年，Jones3等用寡核苷酸構(gòu)建出小鼠抗半抗原一一 4- 羥基-3-硝基苯乙

6、?；核?NP)的免疫球蛋白VH基因，其中編碼VH互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 的序列來自小鼠的單抗，編碼構(gòu)架區(qū) (FR) 的序列來自與鼠抗 NP 單抗的 FR 同源程度 較高的人骨髓瘤蛋白，通過人抗 NP 重鏈可變區(qū)基因 (hVHNP) 與含有人重鏈恒定區(qū)序 列的表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)染到只分泌抗 NP輕鏈的小鼠雜交瘤細(xì)胞J558L中，結(jié)果獲 得可特異結(jié)合 NP 的人源化嵌合抗體。康向東等 4從分泌抗人甲狀腺球蛋白的雜交瘤細(xì) 胞株hTg-60中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出鼠源性單克隆抗體 hTg-60 的 VH 及 VL 基因，經(jīng)基因測(cè)序分析，設(shè)計(jì)出人源化抗體的基因引物，獲得

7、抗 Tg 單克隆抗體人源化 VH 及 VL 基因并將其克隆入真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢 細(xì)胞(CHO)，表達(dá)人源化嵌合hTg抗體。成功獲得了 6株能穩(wěn)定分泌抗hTg人源化嵌合 抗體的細(xì)胞株。2 CDR 移植抗體的構(gòu)建盡管嵌合抗體Fc段換成了人源化，但V區(qū)保留的鼠源性保守序列仍能誘發(fā) HAMA， 因此嵌合抗體不能徹底地消除鼠免疫原性，還需進(jìn)一步對(duì)鼠源抗體的 V 區(qū)進(jìn)行改造。 抗體V區(qū)由CDR和骨架區(qū)(FR)組成。CDR是抗體識(shí)別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決 定了抗體的特異性，而骨架區(qū)序列及其立體結(jié)構(gòu)較為保守，是嵌合抗體誘發(fā) HAMA 的主要原因，因此將鼠單克隆抗體 CDR 移植到人單克隆抗體的

8、V 區(qū)框架上，使人單克隆 抗體獲得鼠單克隆抗體結(jié)合特異性，并減少異源性。這樣獲得的改型抗體也稱 CDR 移 植抗體（CDR grafting antibody）。然而，抗原雖然主要和抗體的 CDR接觸，但FR區(qū)也 常參與作用，影響 CDR 的空間構(gòu)型。因此換成人源 FR 區(qū)后，這種鼠源 CDR 和人源 FR相嵌的V區(qū)，可能改變了單抗原有的 CDR構(gòu)型，往往明顯降低抗原-抗體反應(yīng)的親 和力， 甚至喪失與抗原結(jié)合的能力 5。因此解決骨架區(qū)對(duì) CDR 的影響，對(duì) CDR 序列 和框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和加工是十分重要的。 V區(qū)CDR移植的設(shè)計(jì)原則是：（1）以Kabat 的方法為基礎(chǔ)選擇頂端環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列和緊

9、鄰 CDR 兩側(cè)的骨架序列： （2）對(duì)骨架區(qū)中影 響抗原結(jié)合部位的氨基酸殘基改為親本鼠單克隆抗體的殘基；（3）對(duì)抗體 V 區(qū)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫分析，選擇與親本鼠單克隆抗體同源性高的序列；（4）保留V區(qū)N末端氨基酸序列，尤其是L鏈V區(qū)N末端序列。將人改型V區(qū)基因與人Ig C區(qū)基因連接，構(gòu) 成完整的人免疫球蛋白基因即可進(jìn)行表達(dá)。 Couto 等6首先利用計(jì)算機(jī)模建和實(shí)驗(yàn)探索 找到一個(gè)最簡(jiǎn)模板。以此模板對(duì)抗乳腺表皮抗原 BA46 的抗體 Mc3 成功地進(jìn)行了人源 化。由于人源化抗體（嵌合或CDR移植抗體）內(nèi)還含有10%30%的鼠源蛋白，因而 在臨床應(yīng)用時(shí)， 或多或少地存在一些免疫排斥反應(yīng)， 沒有達(dá)到治

10、療性抗體發(fā)展的最終目 標(biāo)抗體完全人源化。3 完全人源化抗體的構(gòu)建全人源化抗體是指將人類抗體基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)， 將人類編碼抗體的 基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動(dòng)物中， 使動(dòng)物表達(dá)人類抗體， 達(dá)到抗體 完全人源化的目的。目前生產(chǎn)完全人源化抗體的方法主要包括抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，這 2 種制備 技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)至今，孰優(yōu)孰劣尚未可知 7 。3.1 抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn)開創(chuàng)了一條簡(jiǎn)便快捷的基因工程抗體生產(chǎn)路線， 為人源化 抗體的制備提供了新途徑。 噬菌體抗體庫 （ phage antibody library） 技術(shù)是 20 世紀(jì) 90 年 代初期抗體工程領(lǐng)域的重大研究進(jìn)

11、展， 它結(jié)合了噬菌體展示與抗體組合文庫技術(shù)， 把外源的DNA插入噬菌體編碼的外殼蛋白pM或p毗的基因中，使外源 DNA片段對(duì)應(yīng)的 表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體外殼蛋白中形成融合蛋白。 此方法包括噬菌體庫的產(chǎn)生、 結(jié)合抗 原的展示抗體的篩選、 展示有高親和力抗體的噬菌體擴(kuò)增、 有高親和力的抗體的分離和 定性的具體步驟 8。其基本方法是從人外周血淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞中提取RNA 或基因組DNA，設(shè)計(jì)核苷酸引物，用 PCR方法克隆人全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因組裝到噬 菌體表達(dá)載體內(nèi)， 與噬菌體外殼蛋白基因融合， 感染大腸桿菌并使抗體片段表達(dá)于噬菌 體。然后利用抗原抗體特異性結(jié)合而篩選出所需要的抗體， 并進(jìn)行克

12、隆性擴(kuò)增， 獲 得可溶性抗體片段(如Fab、scFV及dsFv等)，即噬菌體抗體9。1989年美國Scripps研 究所 Lerner 實(shí)驗(yàn)室首次應(yīng)用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建了噬菌體抗體庫 10。該技術(shù)在制 備基因工程抗體方面發(fā)展迅速， 國內(nèi)外已有人源或鼠源抗 HBV、HIV、RSV、TNF、erbB2、 gp120 等噬菌體抗體的報(bào)道。 Vitaliti 等11利用噬菌體抗體庫技術(shù)制備了抗血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子(VEGF)的scFv，能明顯減慢腫瘤的生長(zhǎng)。何小鵑12、朱建高13等利用該技術(shù) 成功構(gòu)建了大腸癌噬菌體抗體庫和鼻咽癌抗獨(dú)特型抗體庫， 并從中篩選出全人源抗大腸 癌單鏈抗體和鼻咽癌抗獨(dú)特型單

13、鏈抗體。我國研究者成功地從SARS病毒噬菌體抗體庫 中篩選出具有中和活性的抗 S 蛋白 Fab 片段抗體，體外實(shí)驗(yàn)證明其可部分中和 SARS 病毒活性，能明顯延緩細(xì)胞病變的過程 14。3.2 轉(zhuǎn)基因技術(shù)全人抗體還可以通過小鼠的基因工程免疫方法獲得。 產(chǎn)生一免疫反應(yīng)的基因工程敲 除鼠，然后用雜交瘤技術(shù)使小鼠的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。 通過滅活內(nèi)源 性的小鼠抗體基因， 然后引進(jìn)人源抗體基因片段， 當(dāng)對(duì)人源抗體免疫的時(shí)候就可以在小 鼠體內(nèi)產(chǎn)生全人抗體分子。 另一種方法是將人抗體基因微位點(diǎn)轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染 色體小鼠的免疫抗原基因環(huán)境和人類非常相似。 還有一種不同的方法是向免疫供體或混

14、 合性嚴(yán)重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴細(xì)胞， 通過抗原免疫使小鼠脾細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì) 胞15。轉(zhuǎn)基因小鼠制備的人抗體， 其功效優(yōu)于其他技術(shù)生產(chǎn)的抗正常人體蛋白單抗。 小鼠 識(shí)別抗原和動(dòng)員抗原的抗體系統(tǒng)仍保持完整， 容易把人體蛋白識(shí)別為異物。 此外，由于 抗體是體內(nèi)產(chǎn)生的， 經(jīng)歷了正常裝配和成熟過程， 從而保證成品具有較高的靶結(jié)合親和 力。但轉(zhuǎn)基因小鼠也存在一些缺陷， 即轉(zhuǎn)基因通常有體細(xì)胞突變和其他獨(dú)特的序列， 導(dǎo) 致不完整的人序列； 而且， 由于抗體是在小鼠體內(nèi)裝配， 因而產(chǎn)生的單抗具有鼠糖基化 的模式，所以這些單抗最終并不是全人源化的。需要進(jìn)一步研究以改進(jìn)此技術(shù)。4 總結(jié)限于嵌合抗體和改型抗體仍

15、保留部分免疫原性， 仍會(huì)導(dǎo)致部分反應(yīng)， 現(xiàn)在研究者已 經(jīng)漸漸開始轉(zhuǎn)向更安全有效的全人抗體。 最早制備全人抗體的方法是采用噬菌體表面呈 現(xiàn)技術(shù)篩選獲得的針對(duì)目標(biāo)抗原的人抗體可變區(qū)基因， 再采用基因工程技術(shù)進(jìn)行重組表 達(dá)，但是這種全人抗體往往親和力較低。 現(xiàn)在，全人抗體幾乎完全轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。 為了使用更低廉的生產(chǎn)成本獲得更大的生產(chǎn)能力，研究者發(fā)展了動(dòng)物乳腺反應(yīng)器技術(shù)， 將抗體基因轉(zhuǎn)移至山羊或牛的體內(nèi)， 特異地在乳腺中表達(dá)， 表達(dá)的抗體被分泌到動(dòng)物的 乳汁中從而可被收集純化 16 。如果能更好地解決畜群的傳代問題，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人 源化抗體的技術(shù)必將得到廣泛的應(yīng)用， 極有可能代替動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，

16、 成為大規(guī)模生產(chǎn)人 源化抗體藥物的常規(guī)技術(shù)。參考文獻(xiàn)1 Milstein KG. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificityJ. Nature, 1975, 256(7): 495.2 朱學(xué)泰，謝溱，馬瑞君.單克隆抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展J.甘肅科技,2005,21(3): 108.3 Jones PT, Dear PH, Foote J. Replacing the complementarity-determining regions in ahuman antibody with t

17、hose from a mouse J. Nature, 1986, 321: 522.4 康向東，馬艷春，張隆等.抗人甲狀腺球蛋白人源化單克隆抗體的制備J.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,24(2):97-100.葛彥.人源化抗體研制策略分析及應(yīng)用研究J.國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，2004, 27(5): 271.6 王臣,溫文彥 ,張春杰 .鼠源單克隆抗體人源化研究進(jìn)展 J. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ,2006,34(11) :2336 -2337.7 林蕓,閻錫蘊(yùn).人源化抗體研究歷程及發(fā)展趨勢(shì) J. 生物工程學(xué)報(bào),2004, 20(1): 1.8 張忠東，成軍,張樹林.噬菌體展示技術(shù)的原理及應(yīng)用J.世界華人消化雜志

18、,2003, 4:459-461.9 初曉霞，侯明.抗血小板人源化抗體的研究進(jìn)展J中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005,13(5):915-917.10 Barbas CF, Kang AS, Lerner RA, et al. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: the genelH site J. Proc Natl Acard Sci USA, 1991,88(18): 7978.11 Vitali A, Witter M, Steiner P, et al. Inhibition of tumor angiogenners by a single- chain antibody detected against vascular endothelial growth- factor J. Cancer Res, 2000, 60 (16):4311.12 何小鵑，李官成,朱建高.鼻咽癌人源抗獨(dú)特型單鏈抗體的制備及篩選J.癌癥,2004, 23(2): 124.13 朱建高，李官成,孫去病等.全人源化抗結(jié)腸癌單鏈抗體基因的克隆和表達(dá)J.生物工 程學(xué)報(bào), 2001, 7(5): 526.14 康曉平，楊保安,趙慧.從噬菌體庫中篩選抗SARS病毒S蛋白的Fa中和活性抗體研究J.中華微生物學(xué)和