實(shí)驗(yàn)一大腸桿菌基因組提取

1、在實(shí)驗(yàn)開始，首先對實(shí)驗(yàn)的一些必須步驟（注：在幾乎每一次小實(shí)驗(yàn)都會使用到的試驗(yàn)方法）做一定的解釋。避免在寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告的過程中太過混亂！并且這些過程并不是每一位同學(xué)都參與了的，故在本實(shí)驗(yàn)報(bào)告的開篇寫出。（一）制備1%的瓊脂糖凝膠稱取1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100 mL的1 × TAE緩沖液，在微波爐中加熱。完全融化后，取出搖勻。（二）膠板的制備1. 用橡皮膏將膠板的兩端邊緣封閉好。2. 將膠板放在水平處，放好樣品梳子。 3. 將冷卻到60左右的瓊脂糖凝膠緩慢倒入膠板中，注意不要產(chǎn)生氣泡。膠的厚度在3-5mm之間。4. 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放入電泳槽內(nèi)（注意：梳子的方向靠

2、近負(fù)極）。5. 向電泳槽中加入1 × TAE緩沖液，緩沖液要浸沒凝膠。（三）加樣1. 在樣品中加入適量的10 ×上樣緩沖液，使緩沖液的終濃度為1×。 2. 用微量移液器將已加入緩沖液的樣品加入上樣孔中。記錄加樣的順序和加樣量。（注意：加樣的過程中不要讓樣品溢出上樣孔）（四）電泳 1. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意DNA片段是從負(fù)極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比。最高電壓不超過5V/cm。2. 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到凝膠的2/3處時(shí)，停止電泳。（五）染色將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中（帶手套操作）。（六）觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈（360 nm或254 nm

3、）下觀察染色后的凝膠，DNA處顯出橘紅色的熒光條帶。實(shí)驗(yàn)一 大腸桿菌基因組提取【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌基因組的提取方法【實(shí)驗(yàn)原理】DNA是一個(gè)環(huán)形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)。不同種屬的生物，以及不同形式的細(xì)胞（如菌類、培養(yǎng)細(xì)胞、植物組織，動物組織）基因組提取的方法是不同的，但其基本原則是類似的，即既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。SDS的

4、作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵受到破壞，失去二級結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的情況下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可通過失活蛋白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物

5、與蛋白，多糖類物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或異丙醇而除去?！緦?shí)驗(yàn)材料】 大腸桿菌DH5菌液【實(shí)驗(yàn)試劑】 LB液體培養(yǎng)基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/異戊醇，異丙醇，70%乙醇【實(shí)驗(yàn)儀器與用具】 微量移液器，低溫離心機(jī)，水浴鍋，eppendorf管，恒溫?fù)u床【實(shí)驗(yàn)步驟】 （1）將2mL培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌DH5菌液5000rpm冷凍離心10min棄上清； （2）加190L TE懸浮沉淀，并加10L 10%SDS，1L 20mg/mL蛋白酶K，混勻，37保溫1h； （3）加30L 5mol/L Na

6、Cl，混勻； （4）加30L CTAB/NaCl溶液，混勻，65保溫20min； （5）加入300L酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm離心10min，將上清液移至干凈離心管； （6）加入300L氯仿/異戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干凈管中； （7）加300L異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10min，沉淀DNA； （8）5000rpm離心10min，沉淀DNA，加入500L70%乙醇，5000rpm離心10min，棄乙醇，吸干； （9）溶解于20LTE，取3L 用于瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，其余-20保存?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】10 9 8 7 6 M如圖所示，8號為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7、對比maker,第一條帶為正常大腸桿菌基因組，中間可以看見模糊的兩條帶，可能為斷裂的基因組片段，下面最亮的為RNA。出現(xiàn)斷裂的基因組可能是由于操作過于劇烈。本組電泳帶還比較清晰整齊，其他組不整齊的帶可能是電泳技術(shù)問題。RNA含量很大，所以出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)二 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及驗(yàn)證【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1.掌握感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化的原理 2.學(xué)習(xí)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法 3.為重組子的轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備【實(shí)驗(yàn)原理】本實(shí)驗(yàn)采用CaCl2制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子

8、的影響。Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70保存。在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：電擊法，CaCl2等化學(xué)試劑法）處理后，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。大腸

9、桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)法（CaCl2法）。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子?！緦?shí)驗(yàn)材料】 大腸桿菌DH5【實(shí)驗(yàn)試劑】 LB液體培養(yǎng)基，0.1mol/Lcacl2溶液【實(shí)驗(yàn)器材】 恒溫?fù)u床，超凈工作臺，高壓滅菌鍋，低溫離心機(jī)，微量移液器【實(shí)驗(yàn)步驟】 一、感受態(tài)細(xì)胞的制備 1.將凍存的菌種1：100接種于3ml的

10、LB液體培養(yǎng)基中，37搖床過夜震蕩培養(yǎng)。 2.取1ml活化菌種接種于100mlLB培養(yǎng)基中，37搖床培養(yǎng)1.5-2h。 3.將菌種在冰上放置10min。4、4000rpm下離心10min收集菌體。 4.棄上清，用事先冰浴的0.1mol/Lcacl2重新懸浮細(xì)胞，冰浴30min。 5.收集菌體，條件同上。 6.棄上清，在冰浴條件下加入0.1mol/Lcacl2溶液。 7.分裝保存（40%甘油與感受態(tài)細(xì)胞1：1混合，使甘油的終濃度為20%）。 二、驗(yàn)證 （一）制備含Amp的藍(lán)白斑篩選瓊脂平板 1.LB固體培養(yǎng)基融化后，待冷卻到60 左右，加入氨芐青霉素（工作濃度為100 µg/mL），混

11、勻，倒入培養(yǎng)皿中。 2.培養(yǎng)基凝固后，在瓊脂平板上加入40µL的20 mg/mL的X-Gal和4µL的200 mg/mLIPTG溶液，用涂布器涂勻。避光保存3h，以利于IPTG和X-Gal 的吸收。 （二）重組子的轉(zhuǎn)化 1. 取200 µL甘油保存的感受態(tài)細(xì)胞，低溫融化后，加入1µL的重組質(zhì)粒（DNA > 50ng），混勻，冰上放置30 min。同時(shí)做兩個(gè)對照：（1）陰性對照： 200 µL感受態(tài)細(xì)胞，不加任何質(zhì)粒DNA。（2）陽性對照： 200 µL感受態(tài)細(xì)胞，加入不帶外源DNA的空載體。 2. 將轉(zhuǎn)化的混合物立即放入42 循

12、環(huán)水浴中90sec（注意：不要晃動）。 3. 然后冰浴2 min。 4. 在轉(zhuǎn)化子中加入600µL不含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 搖床培養(yǎng)1h（慢搖）。 5. 4000 rpm離心5 min，沉淀細(xì)菌細(xì)胞。 6. 用微量移液器去除上清溶液600 µL。7. 將沉淀與剩余的上清混勻，涂在制備好的含Amp的瓊脂平板上。陰性對照的轉(zhuǎn)化混合物，一部分涂于含Amp的瓊脂平板，一部分涂于不含Amp的瓊脂平板上，以檢測感受態(tài)細(xì)胞是否污染。 8. 待菌液完全被吸收后，37 倒置培養(yǎng)12-16 h?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 感受態(tài)細(xì)胞制備成功，而且轉(zhuǎn)化效率比較高。陰性對照沒有出現(xiàn)菌落，

13、結(jié)果正常。分析以及討論： 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響因素 （1）細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為 05時(shí)，細(xì)胞密度在5×107個(gè)/ml左右。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。此外，受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受

14、體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。 （2）質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。 （3）試劑的質(zhì)量所用的Ca

15、Cl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4。 （4）防止雜菌和雜DNA的污染整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。 （5）整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會降低。實(shí)驗(yàn)三 重組子的制備和轉(zhuǎn)化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1.掌握PCR，回收與連接的原理 2.掌握重組質(zhì)粒制備的方法【實(shí)驗(yàn)原理】（一） PCR原理 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)

16、。該技術(shù)能在幾小時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作中，將人為選定的一段DNA擴(kuò)增幾百萬倍，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)。PCR的工作原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，是將待擴(kuò)增的DNA片斷和與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)變性、退火及延伸三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使特定的DNA片斷在數(shù)量上呈指數(shù)增加。PCR擴(kuò)增首先需要一對引物，根據(jù)待擴(kuò)增區(qū)域兩側(cè)的已知序列合成兩個(gè)與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴(kuò)增片段的特異性和片段長度。反應(yīng)體系由模板DNA、一對引物、dNTP、耐高溫的DNA聚合酶、酶反應(yīng)緩沖體系及必須的離子等所組成。PCR反應(yīng)循環(huán)的第一步為加熱變性，使雙鏈模板DNA變性為單鏈；第二步

17、為復(fù)性，每個(gè)引物將與互補(bǔ)的DNA序列雜交；第三步為延伸，在耐高溫的DNA聚合酶作用下，以變性的單鏈DNA為模板，從引物3端開始按53方向合成DNA鏈。這樣經(jīng)過一個(gè)周期的變性復(fù)性延伸等三步反應(yīng)就可以產(chǎn)生倍增的DNA，假設(shè)PCR的效率為100%,反復(fù)n周期后，理論上就能擴(kuò)增2n倍。PCR反應(yīng)一般30-40次循環(huán)，DNA片段可放大數(shù)百萬倍。常規(guī)PCR反應(yīng)用于已知DNA序列的擴(kuò)增，變性溫度為95，復(fù)性溫度為3755，延伸合成溫度為72，DNA聚合酶為Taq酶（可耐受95左右的高溫而不失活），反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30。如圖：（二）DNA重組技術(shù)  重組DNA(Recombinant DNA)

18、技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟： 1）重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應(yīng)用TA克隆方法,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì),設(shè)計(jì)一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。 【實(shí)驗(yàn)器材】PCR擴(kuò)增儀，臺式高速離心機(jī)，移液器，經(jīng)高壓滅菌后的Eppendorf管，電泳儀，回收試劑盒

19、?！緦?shí)驗(yàn)試劑】 （1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50µl的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95溫浴10分鐘, 10000rpm離心5分鐘,取2µl上清液用于總體積50µl的PCR反應(yīng)。（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×擴(kuò)增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買（3）引物（100pmol/L）：設(shè)計(jì)并合成與目的DNA兩側(cè)互補(bǔ)的引物內(nèi)。（4）回收試劑（5）T4 DNA連接酶（6）10 ×

20、; 連接反應(yīng)緩沖液 （6）50% PEG4000 【實(shí)驗(yàn)步驟】一、PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA片段 1. 在已滅菌的0.5 mL的離心管中配制PCR反應(yīng)的25 µL反應(yīng)體系。依次加入下列試劑： Premix溶液 12.5 µL 引物1 1µL引物2 1µL模板DNA 1uL雙蒸水 9.5µL 2. PCR反應(yīng)條件94 1min 94 30sec 50 1min 72 3min 72 5min 4保存, 從第二步至第四步30個(gè)循環(huán)。 3. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和分析PCR結(jié)果。二、DNA片段的回收 在本實(shí)驗(yàn)中，目的DNA片段的回收采用的是北京鼎國生

21、物DNA回收/純化試劑盒 溶液A 100mL 6mol/L NaClO4，0.03mol/L NaAc（pH5.2），少量酚紅溶液B 1.5mL 3mol/L NaAc溶液C 60mL用時(shí)需要加入70mL無水乙醇，充分混勻溶液D 6mL TE緩沖液DNA片段回收方法 （1）切取含DNA片段的瓊脂糖（100mg-300mg），以1：3（切取重量與溶液的A體積比）加入溶液A； （2）50-65水浴5-10min，待凝膠全部溶化，其間振蕩助溶2-3次，加入15L溶液B，充分混勻；（3）將溶液置于離心柱中，靜止2min，10000rpm離心30s；若一次加不完，可分兩次離心；（4）倒掉液體，加500L

22、溶液C于離心柱中，10000rpm離離心30s，棄液體。 （5）重復(fù)步驟（4）一次； （6）12000rpm離心1min，甩干剩余液體，除去殘余的酒精； （7）將離心柱放置于新的離心管中，室溫敞開離心管蓋，放置10min，使乙醇揮發(fā)殆盡； （8）加入20L溶液D（50水?。?，靜止2min； （9）15000rpm離心1min，管底溶液即為所需的DNA； （10）將DNA儲存于貯存于-20冰箱中。三、DNA的重組 在0.5 mL的已滅菌的離心管中依次加入下列溶液T4 DNA連接酶 1 µL10 × 連接反應(yīng)緩沖液 2 µLPUCm-T 載體 9 µL 純化

23、后的PCR產(chǎn)物 8 µL16連接過夜。上面載體及目的片段量是根據(jù)本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的，在實(shí)際操作中要根據(jù)具體情況而定，若體系不足20µL則用無菌水補(bǔ)足至10µL?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】PCR回收結(jié)果 10 9 8 7 6 M 5 4 3 2 18號泳道為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相對于PCR結(jié)果來講，回收效率不是很高，可能原因分析如下： 1.切膠時(shí)膠塊體積太大，溶膠效果不好 2.DNA吸附后洗脫不完全3.操作過程中的損失實(shí)驗(yàn)四 重組子轉(zhuǎn)化及篩選【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握DNA重組技術(shù)的基本原理和基本方法【實(shí)驗(yàn)原理】1、將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。 2、克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)

24、基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量含重組DNA的細(xì)菌。 4）收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。3、藍(lán)白斑篩選：IPTG可誘導(dǎo)lacZ形成肽鏈,該產(chǎn)物能與有缺陷的宿主細(xì)胞所編碼的N-末端發(fā)生基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點(diǎn)后, 使其編碼的肽鏈?zhǔn)セ钚? 使其不能形成-互補(bǔ), 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。 【實(shí)驗(yàn)步驟】

25、 （1）取200 µL甘油保存的感受態(tài)細(xì)胞，低溫融化后，加入重組質(zhì)粒，混勻，冰上放置30 min；（2） 將轉(zhuǎn)化的混合物立即放入42 循環(huán)水浴中90sec（注意：不要晃動）；（3） 然后冰浴2 min；（4） 在轉(zhuǎn)化子中加入600µL不含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 搖床培養(yǎng)1h（慢搖）；（5） 4000 rpm離心5 min，沉淀細(xì)菌細(xì)胞；（6） 用微量移液器去除上清溶液600 µL； （7）將沉淀與剩余的上清混勻，涂在制備好的瓊脂平板上；（8） 待菌液完全被吸收后，37 倒置培養(yǎng)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果及分析】用所制備的感受態(tài)，對連接所制備的重組子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果，

26、結(jié)果正確。其中，陽性菌落即白色菌落。原因是根據(jù)藍(lán)白斑篩選的原理，當(dāng)外源基因DNA片段插入多克隆位點(diǎn)后, 使其編碼的肽鏈?zhǔn)セ钚? 使其不能形成-互補(bǔ), 因此帶有外源基因重組子的細(xì)菌形成白色菌落。而我們所構(gòu)建的重組子即由我們的目的片段插入到載體的多克隆位點(diǎn)，使不能形成-互補(bǔ)，則使菌落呈白色。實(shí)驗(yàn)五 菌種保存及質(zhì)粒DNA的小量提取酶切驗(yàn)證【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1.掌握菌種保存的方法 2.掌握質(zhì)粒DNA小量提取的原理及方法 3.酶切驗(yàn)證重組子的轉(zhuǎn)化是否正確【實(shí)驗(yàn)原理】 實(shí)驗(yàn)采用-70保存菌種，使菌種的代謝處于最低狀態(tài)。堿裂解法提取質(zhì)粒的原理是在EDTA存在的條件下，用溶菌酶破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，同時(shí)經(jīng)過NaOH和

27、陰離子去污劑SDS處理，使細(xì)胞膜崩解，從而達(dá)到菌體充分的裂解。此時(shí)，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞膜碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來。而質(zhì)粒DNA則留在上清液內(nèi)，其中還含有可溶性蛋白質(zhì)、核糖核蛋白和少量染色體DNA，實(shí)驗(yàn)中加入蛋白質(zhì)水解酶和核糖核酸酶，可以使它們分解，通過堿性酚（pH8.0）和氯仿異戊醇混合液的抽提可以除去蛋白質(zhì)等等。異戊醇的作用是降低表面張力，可以減少抽提過程中產(chǎn)生的泡沫，并能使離心后水層、變性蛋白層和有機(jī)層維持穩(wěn)定。含有質(zhì)粒DNA的上清液用乙醇或異丙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。小提質(zhì)粒所用溶液配方：1. 溶液50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris· HCl（三羥甲基氨基甲烷）pH 8.010 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸） pH8.02. 溶液0.4 mol/L NaOH2% SDS用前等體積混合3. 溶液5 mol/L乙酸鉀 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL【實(shí)驗(yàn)材料】 大腸桿菌DH5菌液，RNA酶【實(shí)驗(yàn)試劑】 LB液體、固體培養(yǎng)基，40%甘油，小提質(zhì)粒裂解液、，酚氯仿，無水乙醇，70%乙醇【實(shí)驗(yàn)儀器與用具】 微量移液器，培養(yǎng)皿，試管，恒溫?fù)u床，凍存管，低溫離心機(jī)，離心管，吸水紙【實(shí)驗(yàn)步驟】 （一）菌種的保存1. 挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接于3m