大腸桿菌授課PPt

1、食品中大腸菌群的檢驗與食品中大腸菌群的檢驗與分析分析組長：組員： 一、 目的1、了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。2、練習(xí)并掌握大腸菌群的檢驗方法。二、原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在37、24小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的亞屬細(xì)菌組成。典型大腸桿菌的IMViC與硫化氫實驗結(jié)果為+-2、測定的意義該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品

2、中大腸菌群數(shù)系以每1g（或mL）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN（themostprobablenumber-簡稱MPN）表示3大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自

3、凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46。三 、 材料1、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。2、陽性對照菌大腸桿菌3、 儀器設(shè)備除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、 均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器等。 4、 培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯、 煌綠乳糖膽鹽（BGLB ）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ) 、無

4、菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH ) 、 1mol/L 鹽酸（HCI ) 。 每個組準(zhǔn)備的東西：250ml錐形瓶（一個是含有225ml的生理鹽水，另一個是結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂）12支試管（3支9ml生理鹽水，7支月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯）1支10ml無菌移液管6支1ml無菌移液管（沒有備用試管，請謹(jǐn)慎使用）8個無菌培養(yǎng)皿（沒有備用器皿，請謹(jǐn)慎使用） 四、 檢驗方法第一法 大腸菌群MPN計數(shù)法。第二法 大腸菌群平板計數(shù)法。試驗流程第一法 大腸菌群MPN計數(shù)法1、樣品的稀釋（1） 固體和半固體樣品 稱取25g 樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌

5、均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min-10000r/min 均質(zhì)1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的樣品勻液。（2） 液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10 的樣品勻液。（3） 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.5-7.5 之間，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸（HCI ）調(diào)節(jié)。（4） 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9

6、mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。（5）、 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。 2、 初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）, 361 培養(yǎng)24h2h ，觀察倒管內(nèi)

7、是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h 。記錄在24h 和48h 內(nèi)產(chǎn)氣的LST 肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。（請大家明天中午過來觀察，并且記錄）3、 復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有48h2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB）肉湯管中，361 培養(yǎng)48h2h ，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。4、 大腸菌群最可能數(shù)（MPN ）的報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN 表（見附錄B ) ，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN 值。注意：當(dāng)檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也應(yīng)相應(yīng)減少或增加。 試驗流

8、程1、 樣品的稀釋直接使用按第一法中的稀釋液進(jìn)行。2、 平板計數(shù)（1） 選取2個3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2） 及時將15 mL-20mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36l 培養(yǎng)18h-24h 。2、 平板計數(shù)（3） 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。2、 平板計數(shù)（4）、 證實試驗 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，361 培養(yǎng)24h-48h ，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。2、 平板計數(shù)（5）大腸菌群平板計數(shù)的報告 經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中