骨髓間充質干細胞的分離分化及研究進展

1、骨髓間充質干細胞的分離分化及研究進展摘要:骨髓間充質干細胞是存在于骨髓基質中的非造血系細胞,它們能夠分化成中胚層和非中胚層細胞。骨髓間充質干細胞主要有4種體外分離方法:貼壁篩選法,密度梯度離心法,流式細胞儀分離法和免疫磁珠分離法。由于骨髓間質干細胞具有多方面的優(yōu)勢,越來越受到人們的關注,研究也越來越深入。本文從來源、形態(tài)、體外分離培養(yǎng)及應用前景幾個方面做一綜述,為相關研究提供參考。關鍵詞:骨髓間充質干細胞;分離培養(yǎng);分化骨髓由造血組織和基質構成,近年的研究表明,在骨髓基質中存有間質干細胞(me5enchyma15temcel15,MSCS,骨髓原始間充質干細胞是骨髓基質干細胞,對骨髓中的造血干

2、細胞(HSC不僅有機械支持作用,還能分泌多種生長因子(如IL-6,IL-11,LIF,M-CSF及SCF等來支持造血,體內(nèi)外實驗已證明它具有多向分化潛能,在一定的誘導條件下MSCS具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、肌鍵細胞、脂肪細胞等中胚層細胞分化的能力。因此它已成為醫(yī)學界近來研究的熱點,但骨髓中MSCS含量很少,每1萬10萬個單核細胞中大約有1個MSCS,難以滿足實際應用的需要,因此體外分離純化MSCS,研究其培養(yǎng)特性,獲得大量穩(wěn)定的MSCS具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。1. 骨髓間質干細胞的來源在生物個體的發(fā)育過程中先后出現(xiàn)胚胎干細胞和成體干細胞,具有多向分化潛能的間質干細胞作為一種成

3、體干細胞來源于中胚層間充質,主要存在于全身結締組織和器官間質中,以骨髓組織中含量最為豐富,在人的骨髓中約占單個核細胞數(shù)的1/11051。間充質干細胞是一類貼壁基質細胞,可以向間質組織分化,包括骨組織,軟骨組織,脂肪組織。目前研究較多的間質干細胞主要來源于臍帶血、外周血及脂肪組織。MSCS的獲得主要來自于骨髓的抽吸,人類MSCS一般從髂前上棘吸取,也可從脛骨、股骨、胸骨、腰椎等骨中獲取,大動物MSCS的獲取部位與人類相同,兔需抽取中段脛骨或股骨的骨髓。2. 骨髓間質干細胞的細胞形態(tài)體外培養(yǎng)的MSCS體積小,成梭形或多角形,核漿比大,多為平行排列生長或漩渦狀生長,部分貼壁細胞可以快速形成集落,一些

4、呈典型的紡錘形樣的MSCS增殖迅速,形態(tài)均一。細胞傳代后,傳代細胞較原代細胞的貼壁速度快,細胞傳到第3代時細胞形態(tài)比較一致。在光鏡和相差顯微鏡下,MSCS為長梭形,類似成纖維細胞外觀。透射電鏡下MSCS可表現(xiàn)為兩種不同的形態(tài)結構類型:一種是處于相對靜息狀態(tài)的細胞,核較大,核質比大,胞質內(nèi)細胞器少;另一種是處于相對活躍期細胞,細胞體積大于前者,核不規(guī)則,含23個核仁,核質比小,胞質中有豐富的細胞器。3. 骨髓間質干細胞的體外分離方法體外從骨髓分離獲得的方法主要有貼壁法,密度梯度離心法,流式細胞術和免疫磁珠分離法2,但更理想的分離純化方法還有待于進一步的摸索。貼壁篩選法是利用細胞貼壁時間及貼壁牢固

5、性的不同逐步將非貼壁細胞和其它雜質細胞去除的一種簡單易行的培養(yǎng)MSCS的方法。貼壁分離培養(yǎng)法分離的MSCS能在體外培養(yǎng)條件下生長良好、可連續(xù)傳代,體外培養(yǎng)擴增能力較強,其缺點是細胞純度較低3。此方法簡便,沖出骨髓直接培養(yǎng),然后利用骨髓MSCS貼壁生長特性,更換培養(yǎng)液逐步去處漂浮生長的造血系細胞即可獲得較純化的MSCS;而且骨髓中的造血干細胞能分泌生長因子和促貼壁物質,可促進MSCS貼壁生長,因此全骨髓貼壁法更為可取。密度梯度離心法梯度離心法的核心主要是基于密度梯度離心技術。梯度離心法是根據(jù)骨髓中細胞成分的比重不同,使用淋巴細胞分離液提取單個核細胞,再進行貼壁培養(yǎng),從而達到分離、純化MSCS的目

6、的。Pittenger等的研究發(fā)現(xiàn)通過密度梯度離心分離培養(yǎng)的間充質干細胞在第一代時純度可以達到95%4。常用的分離方法免疫磁珠法,是利用免疫學的技術分離MSCS,分離細胞的純度高。Phinney5用一種免疫耗損技術精確地將造血細胞系和內(nèi)皮細胞系從基質細胞中分離出來,提供了一種能高效的分離純化間充質干細胞的方法,但目前仍未篩選到真正特異性的細胞表面標記;而且,這兩種分離方法的操作對細胞活性都有較大影響,造成MSCS損傷,出現(xiàn)增殖緩慢等問題,這些技術問題很大程度上限制了這兩種方法的應用。因此,如何能簡便高效地獲得均質性的間充質干細胞和細胞群仍需要繼續(xù)探索。分離細疫磁珠分離和流式細胞儀篩選的方法,不

7、僅對細胞活性影響較大,而且操作復雜,價格昂貴。然而,這些純化間充質干細胞的方法比較復雜,一般僅限于在各自的實驗室應用。因此,如何能簡便高效地獲得均質性的間充質干細胞細胞群仍需要繼續(xù)探索。4.骨髓間質干細胞的分化現(xiàn)在的研究揭示骨髓間充質干細胞有分化成多種細胞的潛能6,包括心肌細胞7、肝細胞8、腦中的神經(jīng)細胞和非神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞和肺泡上皮細胞等。在心肌細胞方向分化方面,Fukuda9研究發(fā)現(xiàn)鼠骨髓間充質干細胞在5-氮雜包苷作用下,干細胞形成肌管狀結構并有明顯的細胞之間的交互作用,開始可自發(fā)搏動,最終可以同步搏動,從而說明了間充質干細胞可以誘導為心肌細胞。其他一些研究人員研究表明人胚胎干

8、細胞體外可以分化為不僅具有心肌細胞結構而且還同時具有功能的肌細胞10。有學者用免疫磁珠法分選純化得到小鼠間充質干細胞,雙苯甲亞胺和溴脫氧核苷標記后注入新生小鼠側腦室。骨髓間充質干細胞遷徙到紋狀體、海馬中,并在該處分化為成熟的神經(jīng)膠質細胞。在腦干的網(wǎng)狀結構中出現(xiàn)表達神經(jīng)絲的供體細胞,提示骨髓間充質干細胞可以分化為神經(jīng)元。Verfaillie 11在體外成功地誘導分化為血管內(nèi)皮細胞,同時證明誘導分化而來的內(nèi)皮細胞具有成熟內(nèi)皮細胞的功能,在人工基底膜上可形成血管結構。實驗說明在適宜條件下間充質干細胞能夠向血管內(nèi)皮細胞轉換,可以在體外誘導擴增后作為血管內(nèi)皮細胞移植供體用于血管疾病治療。5.骨髓間質干細

9、胞的應用前景骨髓間充質干細胞是一種成體干細胞,具有較強的可塑性,在體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細胞分化12,同時MSCS還具有獨特的免疫調節(jié)作用。由于MSCS具有來源方便、擴增迅速、可塑性強、離成熟細胞近和多向分化潛能,而且還可以實現(xiàn)個體化治療、無免疫排斥問題和倫理之爭等,因此是最具有臨床應用優(yōu)勢的種子細胞,在創(chuàng)傷修復、組織或器官重建、退行性疾病、遺傳性疾病、抗腫瘤、抗衰老等方面具有廣闊的應用前景13。近年來,研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞還具有特異性向腫瘤組織遷移的特性,因此有人將其作為基因治療細胞載體攜帶Interferon-14治療基因、溶瘤病毒15靶向到達

10、腫瘤局部,殺傷腫瘤細胞。最新的研究更是發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加,MSCS與纖維母細胞表面抗原的差異會減小,并且用于檢測的一些抗體如CD105、CD166、CD90、CD44、CD29、CD73等也表達于肺或者皮膚的纖維母細胞16 。5.結論MSCS這個概念是由Friedenstein和他的同事在40多年前提出的17。隨后的研究發(fā)現(xiàn)其具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓間質等多種間充質組織分化的潛能18,近來又有研究發(fā)現(xiàn)MSCS與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要的聯(lián)系。因此,如何培養(yǎng)出高純度、穩(wěn)定的MSCS,是進行更深一步研究的基礎。盡管較多的動物實驗、臨床前期實驗和資料表明,MSCS在治療上具有安全性

11、和有效性,但仍然存在其環(huán)境作用和調控機制等方面的問題,諸如與治療相關的細胞移植、移植物移入、歸位和體內(nèi)的分化等仍需進一步研究。干細胞治療的廣泛運用必須依賴于有效的、大規(guī)模的培養(yǎng)、儲存,而支架對其運用也起著相當重要的作用。在過去干細胞研究中對MSCS生物學特性已有了相當?shù)恼J識,這對其運用于臨床治療提供了堅實基礎,隨著對其特性的不斷揭示,MSCS在臨床治療應用有著理想前景。參考文獻:1 FRIEDENSTEIN A J, PETRAKOV A K V, KUROLESOV A A I,et a.l Heterotopic ofbonemarrow Analysis ofprecursor cell

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