中藥對(duì)乳酸桿菌與解脲脲原體臨床分離株的體外抑制實(shí)驗(yàn)研究

1、中藥對(duì)乳酸桿菌與解脲脲原體臨床分離株的體外抑制實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】  目的測(cè)定7味中藥對(duì)解脲脲原體（Uu）臨床分離株及乳酸桿菌的影響。方法用微量稀釋法測(cè)定柴胡、蛇床子、苦參、黃連、槐花、野菊花、夏枯草對(duì)Uu臨床株的最小抑菌濃度（MIC值）以及體外抑制乳酸桿菌的抑菌圈直徑。結(jié)果黃連、夏枯草對(duì)Uu較高敏感，MIC90均為7.81 mg/ml；蛇床子、槐花、野菊花中度敏感，MIC90為31.2562.5 mg/ml；柴胡、苦參不敏感。黃連對(duì)乳酸桿菌的抑菌圈直徑為8 mm，其它中藥均為0 mm。紅霉素

2、對(duì)Uu敏感率為29.41%，對(duì)乳酸桿菌抑菌圈直徑為22 mm。結(jié)論7味中藥體外對(duì)Uu有不同程度的抑制作用，對(duì)乳酸桿菌無影響。紅霉素體外對(duì)Uu及乳酸桿菌均有抑制作用。 【關(guān)鍵詞】  解脲脲原體; 乳酸桿菌； 中藥； 最小抑菌濃度解脲脲原體（Ureaplasma urealyticm, Uu）是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，它不僅引起非淋球菌性尿道炎，還可引起泌尿生殖道多種疾病，如陰道炎、宮頸炎、盆腔炎、不孕不育等。目前西藥首選四環(huán)素類、喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類，但隨著耐藥株的增加，加之強(qiáng)效廣譜抗菌素反復(fù)應(yīng)用引起的副作用、菌群失調(diào)等，使本病治療面臨重重困難。本實(shí)驗(yàn)在原有的基礎(chǔ)上，探討中藥體

3、外對(duì)Uu與乳酸桿菌的作用，旨在為治療Uu感染找到更好的藥物。1  材料與儀器1.1  菌株來源17株Uu臨床分離株及干酪乳桿菌干酪亞種均來源于同濟(jì)性病研究中心實(shí)驗(yàn)室。1.2  藥物中草藥：柴胡、蛇床子、苦參、黃連、槐花、野菊花、夏枯草水煎劑1g/ml（即每毫升相當(dāng)于1 g生藥），由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備。西藥：紅霉素批號(hào)050601(上海先鋒藥業(yè)有限公司)，由同濟(jì)醫(yī)院性病研究中心實(shí)驗(yàn)室制備。1.3  儀器及試劑工作凈化臺(tái)（TDGC2j-0.5和TDGC2j-1/0.5）、手提式壓力蒸氣滅菌器（YXQ.SG41.280）、CO2培養(yǎng)箱（SHEL LRB2

4、300）、液氮生物容器、顯微鏡（CH30RF200）、Uu液體培養(yǎng)基、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。2  方法2.1  中草藥煎劑制備方法分別稱取柴胡、黃連、夏枯草等7味藥材，加入500 ml水，浸泡1 h，電爐煎煮，沸后30 min，過濾，沉渣加水煎煮，再過濾，兩液混合，濃縮至11，離心取上清液，調(diào)整pH值至（6.0±0.5），高壓滅菌10 min，備用。2.2  乳酸桿菌培養(yǎng)基制備方法參照凌代文1乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法。2.3  最小抑菌濃度（MIC值）測(cè)定方法微量稀釋法測(cè)定中草藥煎劑的MIC值：Uu培養(yǎng)及其CCU（顏色改變單位）測(cè)定按（Robe

5、rtson JA,1982）方法2，中草藥煎劑的MIC測(cè)定按文獻(xiàn)(Kenny GE,1986)方法略加改進(jìn)。2.3.1  菌液準(zhǔn)備將Uu株復(fù)蘇后，傳代3次，取第3代對(duì)數(shù)生長期（106CCU/ml），稀釋20倍作為工作菌液。2.3.2  加Uu液體培養(yǎng)基在96孔 (8×12)板上第1孔加培養(yǎng)基150 l,第12孔加200 l,第211孔各加100 l。2.3.3  加藥物第1，2行第1孔各加藥物50 l。2.3.4  倍比稀釋藥物從第1孔開始，用微量移液器吹打混勻，吸出100 l至下一孔，再混勻，依次類推，直至第10孔。這樣藥物濃度從第110孔依

6、次為250 mg/ml、125 mg/ml、，共10個(gè)濃度。2.3.5  加Uu菌液第111孔各加100 l。第11孔為陽性對(duì)照，第12孔為陰性對(duì)照。2.3.6  MIC值的判定將培養(yǎng)板蓋上板蓋，置于37恒溫培養(yǎng)箱中孵育。當(dāng)?shù)?1孔陽性對(duì)照孔明顯生長（孔內(nèi)顏色由黃色變?yōu)榧t色）時(shí)，開始判讀結(jié)果，以不出現(xiàn)顏色變化（無Uu生長）孔的最小藥物濃度為抗Uu的MIC值。2.4  抑菌圈直徑測(cè)定方法瓊脂傾注法測(cè)定抑菌圈直徑，方法如下。2.4.1  菌液準(zhǔn)備將乳酸桿菌菌液連續(xù)傳代3次，加入無菌生理鹽水比濁到1.5×108/ml，作為工作菌液。2.4.2

7、0; 加菌液取1 ml工作菌液，平鋪于圓形平皿上。2.4.3  加培養(yǎng)基將瓊脂培養(yǎng)基熔化后，傾注于圓形平皿中輕搖混勻。2.4.4  打孔待瓊脂培養(yǎng)基凝集后，用打孔器在上面打孔，中間1孔，周邊6孔。2.4.5  加藥物中間孔加入紅霉素50 l，周邊孔加入不同濃度的中藥水煎劑50 l。2.4.6  測(cè)量抑菌圈的直徑培養(yǎng)18 h后觀察，如藥物無抑菌作用，則孔周圍長滿乳酸桿菌，如有抑菌作用，則孔周圍無乳酸桿菌生長，形成抑菌圈，測(cè)量抑菌圈的直徑。2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)為計(jì)量資料，采用方差分析及組間

8、比較法。1         3  結(jié)果3.1  7味中草藥與紅霉素體外抗Uu的結(jié)果見表1。表1  7味中草藥與紅霉素對(duì)17株Uu臨床分離株的MIC值（略）中草藥對(duì)病原菌的MIC值，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，參照3國內(nèi)同類實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)為判斷依據(jù)，以MIC90為依據(jù)，黃連與夏枯草對(duì)Uu為較高敏感，蛇床子、槐花、野菊花為中度敏感，柴胡、苦參不敏感。表2  紅霉素對(duì)17株Uu臨床分離株體外抑制作用結(jié)果（略）“”表示無抑制Uu株     根據(jù)曹玉璞主

9、編支原體與支原體病紅霉素抗Uu的MIC值1 g/ml時(shí)為敏感，本實(shí)驗(yàn)17株中，5株敏感，其敏感率為29.41%。參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）1995年制訂的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)紅霉素耐藥標(biāo)準(zhǔn)（即MIC16 g/ml），判定為耐藥臨床株4，本次實(shí)驗(yàn)有兩株為紅霉素耐藥株。3.2  7味中草藥與紅霉素體外抗乳酸桿菌的結(jié)果柴胡、蛇床子、槐花、苦參、夏枯草、野菊花隨著藥物濃度的增大對(duì)乳酸桿菌的抑菌圈直徑均為0 mm。黃連在藥物濃度比較小時(shí)對(duì)乳酸桿菌的抑菌圈直徑為0 mm，當(dāng)藥物濃度增大到125 mg/ml時(shí)，出現(xiàn)抑菌圈，直徑為8 mm。    紅霉素體外抑

10、制乳酸桿菌的抑菌圈直徑見表3。表3  紅霉素體外抑制乳酸桿菌的抑菌圈直徑（略）參照凌代文主編乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法中常見抗菌素對(duì)革蘭氏陽性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈直徑的標(biāo)準(zhǔn)1，本實(shí)驗(yàn)紅霉素在15 g含量時(shí)，抑菌圈直徑為22 mm，判斷紅霉素對(duì)乳酸桿菌中度敏感。4  結(jié)論    7味中藥體外對(duì)Uu有不同程度的抑制作用，對(duì)乳酸桿菌無影響。紅霉素體外對(duì)Uu及乳酸桿菌均有抑制作用。5  分析與討論    Uu感染在中醫(yī)古典醫(yī)籍中沒有明確記載，它所引起的女性生殖系統(tǒng)疾病屬于中醫(yī)“帶下”“陰癢”等范疇。隋·巢元

11、方5諸病源候論中記載：“婦人陰癢，是蟲蝕所為。三蟲九蟲在腸胃之間，因臟虛蟲動(dòng)作，食于陰，其蟲作勢(shì)，微則癢，重者乃痛?！笨梢姽湃穗m分不出支原體、滴蟲、霉菌等病原體，但已認(rèn)識(shí)到陰癢是蟲蝕所為。    Uu是泌尿生殖道感染的常見病原體之一，它不僅引起非淋球菌性尿道炎，還可引起泌尿生殖道多種疾病。目前，Uu的致病機(jī)制尚不清楚，可能與多種因素有關(guān)，如宿主的抵抗力、菌群失調(diào)、Uu血清型別等。正常情況下，Uu寄生在人泌尿生殖道粘膜上，并不致病，當(dāng)陰道酸性環(huán)境遭到破壞，局部抵抗力下降時(shí)，即成為條件致病菌，導(dǎo)致生殖系統(tǒng)炎癥的發(fā)生。有資料6報(bào)道，乳酸桿菌作為正常菌占陰道所有微生物的9

12、5%，而陰道炎患者，乳酸桿菌僅占25%55%。Dominguez等7在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)Uu在乳酸桿菌缺乏時(shí)更常見。    本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連雖對(duì)乳酸桿菌有一定的影響，但對(duì)Uu也有較高敏感作用，是否與它藥配伍能增強(qiáng)黃連抗Uu作用，削弱對(duì)乳酸桿菌的影響，值得我們進(jìn)一步研究。夏枯草對(duì)Uu較高敏感，蛇床子、槐花、野菊花對(duì)Uu中度敏感，并且它們對(duì)乳酸桿菌的抑菌圈直徑為0 mm，說明它們不僅能抑制Uu而且對(duì)乳酸桿菌無影響，為臨床Uu感染的較好藥物。柴胡、苦參體外對(duì)Uu不敏感，但對(duì)乳酸桿菌亦無影響，是否因?yàn)閷?duì)乳酸桿菌無影響，保持陰道正常的酸堿度，對(duì)Uu起到間接的抑制作用，還需

13、深入研究。以上結(jié)果證明中藥不僅有抑制Uu的作用,而且能維持陰道內(nèi)正常的乳酸桿菌。分析原因可能為：中藥對(duì)乳酸桿菌無抑制作用，乳酸桿菌分解陰道粘膜上皮中貯存的糖元產(chǎn)生乳酸，維持陰道的正常酸性環(huán)境。而Uu最適宜在pH為6.06.5的環(huán)境中生長，中藥通過維持陰道的正常酸性環(huán)境，從而破壞Uu的生存環(huán)境，對(duì)Uu起到很好的抑制作用。正常情況下，陰道內(nèi)的乳酸桿菌有序牢固地黏附于陰道粘膜上皮，形成空間性的占位保護(hù)作用。中藥對(duì)這些乳酸桿菌沒有影響，維持了其在陰道上皮的定植抗力，從而阻止外來Uu的入侵。中藥本身含有抑制Uu的有效成分，加上不影響乳酸桿菌，起到扶正祛邪的作用。中藥不抑制乳酸桿菌，乳酸桿菌大量定植于陰道

14、中，其營養(yǎng)處于競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)狀態(tài)，則Uu無足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，不利于生長。并且乳酸桿菌能產(chǎn)生多種抗微生物因子，有效地抑制其它細(xì)菌的生長繁殖，調(diào)整著陰道的菌群失調(diào)，對(duì)Uu也起到很好的抑制作用。    實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，西藥紅霉素體外抑制Uu的同時(shí)，對(duì)乳酸桿菌也有抑制作用。因此，長期使用抗生素會(huì)導(dǎo)致乳酸桿菌數(shù)量的減少，使陰道內(nèi)pH值發(fā)生改變，更重要的是乳酸桿菌數(shù)量減少，其產(chǎn)生的過氧化氫和抗微生物因子亦減少，失去對(duì)陰道內(nèi)一些寄生菌（包括Uu）生長的抑制作用。這可能正是臨床上使用抗生素治療，Uu陽性患者頑固復(fù)發(fā)的一個(gè)重要原因?！疚墨I(xiàn)】  1 凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法

15、,第1版M北京：輕出版社,1998：86.2 Roberson JA,Stemke GW.Expanded serotyping scheme for Ureaplasma urealyticum strains isolated from humansJ.J Clin Micrlbiol, 1982,15:812.3 劉忠儀，張國威，何云志.解脲支原體中藥藥敏試驗(yàn)J.中華皮膚科雜志,1996,29(5)：349.4 陸 原，陳遲燦，李鳴九，等.尿路清對(duì)Uu國際標(biāo)準(zhǔn)株臨床耐藥株的抑菌實(shí)驗(yàn)研究J.中醫(yī)藥學(xué)刊,2002,20(1)：49.5 張玉珍.中醫(yī)婦,第1版M.北京：中國中醫(yī)藥出版社,2002：328.6 楊景云醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué),第1版M北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997:19