銀屑病郎格漢斯細(xì)胞與降鈣素基因相關(guān)肽相互關(guān)系初探

1、銀屑病郎格漢斯細(xì)胞與降鈣素基因相關(guān)肽相互關(guān)系初探神經(jīng)系統(tǒng)與皮膚免疫系統(tǒng)之間的相互作用已引起關(guān)注1，作為皮膚重要神經(jīng)遞質(zhì)的降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptid,CGRP)與表皮和真皮內(nèi)的多種靶細(xì)胞接觸，可直接影響角質(zhì)形成細(xì)胞、郎格漢斯細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，尤其是與表皮樹(shù)枝狀細(xì)胞郎格漢斯細(xì)胞的接觸，可能調(diào)節(jié)皮膚的免疫系統(tǒng)，影響免疫細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的釋放。為探討CGRP與銀屑病郎格漢斯細(xì)胞的關(guān)系，我們用免疫組化法研究證明CGRP存在于銀屑病表皮樹(shù)枝狀細(xì)胞上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用雙相間接免疫熒光染色及激光共聚焦掃描觀察，同時(shí)利用RNA探針原位雜交技術(shù)研究，

2、獲得了有意義的結(jié)果。 一、材料和方法（一）材料：1病例：選擇尋常型銀屑病12例（經(jīng)臨床和組織病理確診），男8例，女4例；年齡2265歲，病程232年。取背及四肢伸側(cè)肥厚斑塊型皮損。并以8例正常人的皮膚組織作對(duì)照。2試劑與儀器：兔抗人CGRP抗體（美國(guó)半島公司），鼠抗人CD1amAb(NA1/34,IgG2a,丹麥Dako公司)，PE標(biāo)記抗鼠IgG抗體（PEMIgG抗體，北京醫(yī)科大學(xué)免疫系），F(xiàn)ITC標(biāo)記抗兔IgG抗體（FITCRIgG抗體，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。CGRPcDNA質(zhì)粒pBKSExon5(由北京醫(yī)科大學(xué)王憲教授惠贈(zèng)，來(lái)自美國(guó)JoYeokley教授)，限制性內(nèi)切酶Xho(寶泰克公司)，地

3、戈辛標(biāo)記NTP(DigNTP)，抗地戈辛AP（抗DigAP）和NBTBCIP（德國(guó)寶靈曼公司），T7和T3RNA聚合酶（Gibco公司），內(nèi)切酶Xba(鼎國(guó)生物公司），雜交液Hyb(ssDNA、DTT、Denhardt、SSC、10葡聚糖硫酸酯、甲酰胺)。激光共聚焦掃描顯微鏡（TCSNT型，德國(guó)Leica公司），DMRIXA顯微鏡和熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）,Olympus顯微鏡（日本）。（二）方法：1雙相間接免疫熒光染色及激光共聚焦掃描觀察：取銀屑病斑塊型皮損及正常皮膚組織新鮮標(biāo)本，OCT包埋冰凍切片（厚5m），經(jīng)丙酮固定10min后PBS清洗。加第一抗體，先用鼠抗人CD1amAb（1

4、100），37孵育60min,PBS清洗，加兔抗人CGRP抗體（1100）37孵育60min,PBS清洗；再加第二抗體，先用PE標(biāo)記抗鼠IgG抗體（120），37孵育60min,PBS清洗，后加FITC標(biāo)記抗兔IgG抗體（110），37孵育60min,PBS清洗，緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡及激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。并以PBS和正常兔血清代替一抗作陰性對(duì)照，以鼠脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。2CGRP原位雜交：(1)制備CGRP的RNA探針：取CGRP質(zhì)粒pBKSExon5（3.2kb，含165bp的CGRP核苷酸系列）加入限制性內(nèi)切酶Xho，經(jīng)37孵育酶切使質(zhì)粒線性化，用Tris酚氯仿/異戊醇提

5、取，乙醇沉淀及水重懸回收，以線性CGRPcDNA作為模板，轉(zhuǎn)錄RNA，加入地戈辛標(biāo)記NTP緩沖液（含DigNTP）和T7RNA聚合酶，混合后在37孵育23h，利用T7啟動(dòng)子從5端合成反向地戈辛標(biāo)記CGRP單鏈RNA探針，并用0.8瓊脂糖凝膠電泳鑒定探針標(biāo)記完成。另外，用內(nèi)切酶Xba在CGRPcDNA的另一端切開(kāi)質(zhì)粒，用T3RNA聚合酶，從3端合成正向CGRP單鏈RNA探針做對(duì)照。(2)組織切片原位雜交：尋常型銀屑病斑塊型皮損10中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，并將CGRP免疫組化陽(yáng)性的皮損石蠟連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，0.05TritonX100室溫孵育10min，用1200蛋白酶K37消化20

6、min，4多聚甲醛固定，90冰乙醇脫水。將雜交液Hyb與反向CGRP探針預(yù)處理，80加熱10min，把含探針的雜交液加入組織切片，置42孵育1622h，雜交后用50甲酰胺SSC液在50洗2次各20min，馬血清（1100）封閉，37孵育30min，加抗DigAp(1500)，37孵育60min，緩沖液洗3次各5min，緩沖液洗15min，NBTBCIP染色，緩沖甘油封片，顯微鏡下觀察。以脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)探針雜交液Hyb和PBS作陰性對(duì)照，并用正向CGRP單鏈RNA探針同時(shí)對(duì)照。二、結(jié)果1雙相間接免疫熒光染色及激光共聚焦掃描觀察：在激光共聚焦掃描顯微鏡下可見(jiàn)，銀屑病斑塊型皮損增厚

7、的表皮內(nèi)，CD1a的郎格漢斯細(xì)胞與PEMIgG抗體結(jié)合發(fā)紅色熒光，同時(shí)其表面有CGRP與FITCRIgG抗體結(jié)合發(fā)綠色熒光，兩種熒光信號(hào)同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞上發(fā)出，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理顯示呈黃棕色，說(shuō)明CGRP陽(yáng)性的細(xì)胞為CD1a的郎格漢斯細(xì)胞。經(jīng)4個(gè)斷層的光切掃描此雙陽(yáng)性細(xì)胞，可見(jiàn)CGRP和CD1a都分布于郎格漢斯細(xì)胞的膜表面，A、B兩個(gè)外層光切面顯示細(xì)胞膜表面的雙陽(yáng)性信號(hào)；C、D兩個(gè)深層光切面則顯示細(xì)胞漿內(nèi)呈陰性，而細(xì)胞膜的陽(yáng)性信號(hào)在邊緣呈環(huán)狀。正常皮膚組織及陰性對(duì)照未見(jiàn)此雙陽(yáng)性細(xì)胞。2CGRP原位雜交：尋常型銀屑病斑塊型（靜止期）皮損組織石蠟連續(xù)切片，經(jīng)反向CGRP的RNA探針原位雜交可見(jiàn)，皮損增厚的

8、表皮樹(shù)枝狀細(xì)胞內(nèi)CGRP的mRNA表達(dá)（1），而PBS和無(wú)探針雜交液Hyb陰性對(duì)照則未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)連續(xù)切片的銀屑病皮損組織用正向CGRP探針作對(duì)照，同步進(jìn)行原位雜交，也未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。1銀屑病皮表皮郎格漢斯細(xì)胞CGRP mRNA表達(dá)（60）三、討論郎格漢斯細(xì)胞是表皮重要的免疫細(xì)胞，攜帶MHC和MHC分子，屬于抗原呈遞細(xì)胞,也是表皮唯一表達(dá)CD1a抗原的細(xì)胞2。由于皮膚感覺(jué)神經(jīng)末梢CGRP反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)纖維，可從真皮突觸伸出穿過(guò)基底膜進(jìn)入表皮內(nèi)，釋放神經(jīng)遞質(zhì)CGRP作用于表皮細(xì)胞3。因此，CGRP與表皮細(xì)胞，尤其是郎格漢斯細(xì)胞的相互關(guān)系，反映了皮膚神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用。我們以往的研究

9、表明，尋常型銀屑病斑塊型皮損內(nèi)CGRP的含量顯著高于正常，而且免疫組化顯示CGRP表達(dá)于表皮的樹(shù)枝狀細(xì)胞。為鑒別這種CGRP陽(yáng)性樹(shù)枝狀細(xì)胞的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)用CGRP和CD1a抗體作用于銀屑病斑塊型皮損組織，并用PEMIgG和FITCRIgG抗體進(jìn)行雙相免疫熒光染色，通過(guò)激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，CGRP存在于表皮CD1a郎格漢斯細(xì)胞上，經(jīng)斷層光切掃描此陽(yáng)性細(xì)胞顯示，CD1a和CGRP都存在于郎格漢斯細(xì)胞膜表面，表明尋常型銀屑病斑塊型皮損內(nèi)神經(jīng)肽CGRP與表皮郎格漢斯細(xì)胞密切接觸，這種接觸可能與CGRP受體的介導(dǎo)有關(guān)。為進(jìn)一步明確銀屑病皮損表皮郎格漢斯細(xì)胞表面CGRP的來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)用反向CGRP的

10、RNA探針作用于銀屑病斑塊型皮損組織，進(jìn)行原位雜交研究，發(fā)現(xiàn)在表皮郎格漢斯細(xì)胞有CGRPmRNA的表達(dá)。以前我們的免疫組化研究也證明，郎格漢斯細(xì)胞上有CGRP的陽(yáng)性表達(dá)。但是，以雙相免疫熒光染色及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察表皮郎格漢斯細(xì)胞不同斷面發(fā)現(xiàn)，CGRP存在于細(xì)胞膜，胞漿內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性著色。對(duì)這一結(jié)果的原因還不完全清楚。是否可能郎格漢斯細(xì)胞CGRPmRNA的表達(dá)量很少，CGRP形成后很快被運(yùn)往表面，以自分泌/旁分泌的形式發(fā)揮作用，還有待我們進(jìn)一步的研究。作者單位：何焱玲（100044北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科）朱鐵君（100044北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科）黃大無(wú)（北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系）丁桂鳳

11、（北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系）張波（北京醫(yī)科大學(xué)分子腫瘤室）王憲（北京醫(yī)科大學(xué)心血管研究所）范少光（北京醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系）參 考 文 獻(xiàn) 1Schelzen T, Armstrong CA, Bunnett NW, et al. Neuropeptides in the skin: interaction between the neuroendocrine and the skin immune system.Exp Dermatol, 1998,7:81 96 . 2Prignano F. Immunophenotype analysis of normal human dendritic cells isolated from epidermis and dermis. Int J Dermato