T∕CVMA 88-2021 牛輪狀簿微滴式數(shù)字RT-PCR檢測方法

1、ICS 11.220CCSB 41團體標準T/CVMA 882021牛輪狀病毒微滴式數(shù)字RT-PCR 檢測方法Method of droplet digital RT-PCR for detection bovine rotavirus2021 - 12 - 23 發(fā)布2021 - 12 - 23 實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā) 布T/CVMA 882021前言本文件按照 GB/T 1.12020標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別這些專利的責(zé)任。本文件由中國獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：吉林省動物疫病預(yù)防控制

2、中心、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：馬曉媛、吳丹、肖丹、白翠、于欽磊、曹東陽、胡澤宇、楊金鑫、朱奕霏。I庫七七 標準下載牛輪狀病毒微滴式數(shù)字 RT-PCR 檢測方法1 范圍本文件規(guī)定了牛輪狀病毒(Bovine Rotavirus ,BRV)微滴式數(shù)字RT-PCR檢測方法的試驗條件、試劑與耗材、儀器與設(shè)備、樣品采集與處理、操作步驟、結(jié)果判定。本文件適用于糞便、組織等樣本中牛輪狀病毒核酸的檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件

3、。GB 19489實驗室 生物安全通用要求GB/T 27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 動物檢疫NY/T 5412016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1微滴式數(shù)字 PCRdroplet digital PCR利用微滴化技術(shù)將一份反應(yīng)體系分成數(shù)萬個納升級的微滴進行定量 PCR 檢測，本質(zhì)上是將傳統(tǒng)PCR 的一次檢測變成數(shù)萬次檢測，提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度。3.2閾值 threshold微滴式數(shù)字 PCR 的閾值是指陽性微滴到空微滴的距離，且此距離應(yīng)大于空微滴到原點的距離。4 試驗條件4.1 生物安全要求所有樣品、培養(yǎng)物和廢棄物的處置應(yīng)符合

4、GB 19489 的規(guī)定。4.2 防污染措施防止污染措施應(yīng)符合 GB/T 27401 的規(guī)定。15 試劑與材料5.1 試劑5.1.1 核酸提取試劑宜選取商品化病毒 RNA 提取試劑盒或等效試劑。5.1.2 樣品處理試劑生理鹽水、青霉素、鏈霉素、 DMEM 培養(yǎng)液。5.1.3 微滴式數(shù)字 RT-PCR 擴增試劑宜按照不同的微滴式數(shù)字 PCR 平臺的說明書選取推薦的微滴式數(shù)字 RT-PCR 擴增試劑。5.1.4 引物和探針BRF 上游引物 （BRV F）：5´-ACAACGTCAACTCTTTCTGGAAA-3´。BRF 下游引物 （BRV R）：5´-AATCGAA

5、AAGCTGGTGAGTGG-3´。BRF 探針 （BRV P）：5´-FAM-AATATGACACCAGCGGTAGCGGC-TAMRA-3´。5.2 質(zhì)控品5.2.1 陽性對照，已知病毒材料，如BRV感染的恒河猴胚腎細胞。5.2.2 陰性對照，未感染的恒河猴胚腎細胞。5.2.3 空白對照，無核酸酶水。5.3 耗材0.22 µm 微孔針頭濾器、濾芯吸頭、96 孔 PCR 反應(yīng)板、無 RNA 酶離心管、微滴式數(shù)字 PCR 平臺專用耗材。6 儀器設(shè)備6.1 生物安全柜。6.2 低溫高速離心機,12 000 r/min 以上。6.3 組織研磨儀。6.4 PC

6、R 擴增儀,溫度范圍: 4 100 。6.5 數(shù)字 PCR 微滴發(fā)生器。6.6 數(shù)字 PCR 微滴分析儀。6.7 核酸定量儀。6.8 渦旋震蕩儀。6.9 移液器，單道 2 L、10 L、20 L、100 L 和 200 L。7 樣品采集與處理7.1 樣品采集2樣品采集按照 NY/T 5412016中 6.7.1、6.7.2 和 6.8.1 中的規(guī)定執(zhí)行。采集的樣品在 2 8 條件下保存應(yīng)不超過 24 h；如需長期保存，應(yīng)放置 -20 下保存，避免反復(fù)凍融。7.2 樣品處理7.2.1 糞便樣品腹瀉犢牛的糞便以5倍體積生理鹽水稀釋后，3 000 r/min、4 離心30 min，取上清液，以0.2

7、2 µm 微孔針頭濾器過濾除菌待檢。7.2.2 組織及內(nèi)容物樣品取小腸和腸內(nèi)容物 0.2 g，用含有 100 IU 青霉素和 100 µg 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液浸泡沖洗兩次，然后剪碎裝進研磨器內(nèi)，在研磨器內(nèi)加入 2 mL 無血清 DMEM 細胞培養(yǎng)液，研磨成糊狀，制成10%組織懸液，10 000 r/min、4 離心 15 min，吸取上清液，用 0.22 µm 微孔針頭濾器過濾除菌待檢。8 試驗步驟8.1 RNA 提取待檢樣品、陽性對照、陰性對照和空白對照按所選取的病毒RNA提取試劑盒說明書進行提取，使用核酸測定儀確定RNA模板含量。8.2 微滴式數(shù)字 R

8、T-PCR 擴增方法每個樣品微滴式數(shù)字RT-PCR擴增體系設(shè)置3個平行。微滴式數(shù)字RT-PCR擴增體系按表1配制，該步驟 根據(jù)不同微滴式數(shù)字PCR平臺的說明書進行操作。試劑成分終濃度體積2×酶混合液a/10.0 LBRV F（10 µmol/L）0.5 µmol/L1.0 µLBRV R (10 µmol/L）0.5 µmol/L1.0 µLBRV P（10 µmol/L）0.1 µmol/L0.25 µLRNA模板/2.0 µL無核酸酶水/5.8 µL總體系/20 

9、1;L注：使用微滴式數(shù)字 PCR 平臺進行實驗時應(yīng)依據(jù)不同微滴式數(shù)字 PCR 平臺說明調(diào)整擴增體系的組分和最終體積，表中所列組分的終濃度不變，并確保每個反應(yīng)體系內(nèi)RNA模板小于 100 ng。：a 微滴式數(shù)字RT- PCR 擴增試劑。表 1微滴數(shù)字 RT-PCR 反應(yīng)體系：8.3 微滴生成反應(yīng)液配制后，利用微滴生成儀完成 20 µL 反應(yīng)體系的分割。8.4 RT-PCR 反應(yīng)3微滴生成后，在PCR擴增儀上進行微滴式數(shù)字RT-PCR擴增。按表2設(shè)置微滴式數(shù)字RT-PCR擴增程序，熒光分析步驟采用FAM單熒光通道。表 2微滴數(shù)字 RT-PCR 擴增程序步驟溫度持續(xù)時間循環(huán)數(shù)14260 m

10、in1295 10 min1395 30 s40458 1 min598 10 min164 60 min1：注：升降溫速度設(shè)置為 2.5 /s，不同PCR反應(yīng)平臺可以根據(jù)說明書對熱啟動步驟程序進行修改，但不能對擴增程序進行修改。8.5 微滴式數(shù)字 RT-PCR 反應(yīng)的質(zhì)量控制進行微滴式數(shù)字RT-PCR實驗時設(shè)置陽性對照、陰性對照與空白對照，各對照RT-PCR擴增體系中， 除模板外，其余組分一致按照表1操作，RT-PCR擴增程序按照表2操作。9 結(jié)果分析9.1 實驗成立條件實驗成立條件如下：微滴式數(shù)字 RT-PCR 擴增結(jié)果，有效微滴數(shù)不得低于理論微滴數(shù)的 60 %。陰性對照組和空白對照組均未檢出陽性微滴，陽性對照有明顯陽性微滴，且核酸拷貝數(shù)濃度10 copies/L，則實驗成立。