細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌接種方法和形態(tài)觀察

1、注意：由于實驗內(nèi)容較多，所以我們只要把藍(lán)色字體部分寫在實驗報告上即可，黑體字部分自己看一下。由于11-13周為教學(xué)質(zhì)量檢查周，督導(dǎo)隨時可能來查，所以預(yù)習(xí)報告還是要寫細(xì)菌、酵母菌、放線菌和真菌接種方法和形態(tài)觀察一、微生物的接種技術(shù)1目的1.1學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)1.2建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)2基本原理將微生物培養(yǎng)物或含有微生物的樣品在無菌條件下移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱為接 種。接種的關(guān)鍵是嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。常用的接種方法有斜面接種、液體接種、穿刺接種、 平板接種和固體接種等。3實驗材料3.1菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、玫瑰暗黃鏈球菌、曲霉、蕁麻青霉的 斜

2、面培養(yǎng)物3.2培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴署葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基及咼氏1號培養(yǎng)基的斜面和平板3.3試劑：5ml無菌生理鹽水試管3.4儀器與其他用品 酒精燈、記號筆、試管、橡膠塞、試管架、接種環(huán)、培養(yǎng)皿、超凈臺等。4操作步驟4.1斜面接種法斜面接種法主要用于傳代活化、純化培養(yǎng)、鑒定或保存菌種。通常先從平板培養(yǎng)基上挑取分離的單個菌落，或挑取斜面，液體培養(yǎng)基中的純培養(yǎng)物接種到斜面培養(yǎng)基上。操作應(yīng)在無菌室、接種柜或超凈工作臺上進(jìn)行。4.1.1 準(zhǔn)備工作將菌種斜面培養(yǎng)基（簡稱菌種管）與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基（簡稱接種管）持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在外側(cè)，接種管在內(nèi)側(cè)，斜面向上管口對齊，并能

3、清 楚地看到兩個試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。4.1.2接種環(huán)滅菌右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以 達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍。4.1.3拔管塞和燒烤試管口用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過， 以殺滅可能沾污的微生物。4.1.4接種環(huán)冷卻和取菌將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出。4.1.5接種接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。不同種類微生物的接種方式各異， 具體如下：（1 ）細(xì)菌和放

4、線菌由斜面培養(yǎng)基底部自下而上來回做“Z”形密集劃線，勿劃破培養(yǎng)基。（2 ）真菌 菌落為局限性生長的曲霉、青霉等采用上下涂布法接種。菌落為擴散性生長的 根霉、毛霉等采用點植法接種。4.1.6塞管塞和接種環(huán)滅菌接種完畢，將接種環(huán)抽出，灼燒管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放 回原處，并塞緊棉塞。將接種管做好標(biāo)記后放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。4.2平板接種法平板接種法就是用接種環(huán)將菌種或用無菌吸管將定量菌液接種至平板培養(yǎng)基的方法，主要用于觀察菌落特征、分離純化菌種和平板活菌計數(shù)。其接種方式有傾注接種、涂布接種、 劃線接種和點植接種。4.2.1傾注平板法（1 ）傾注平板 無菌條件下取適量菌液

5、傾注于平皿中。（2） 倒平板 將滅菌好的培養(yǎng)基倒入平皿，并迅速輕輕旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液充分混勻。（3）培養(yǎng)培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.2.2涂布平板法（1）倒平板 將滅菌好的培養(yǎng)基倒入平皿。（2） 涂布平板無菌條件下吸取菌液滴加于平板培養(yǎng)基表面中心位置，左手持平皿并將皿蓋打開一縫，右手持涂布棒將菌懸液自平板中央以同心圓方向輕輕向外涂布擴散，使之分布均勻，靜置5-10min，使菌液浸入培養(yǎng)基。（3）培養(yǎng) 培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.2.3平板劃線法（1）倒平板 將滅菌好的培養(yǎng)基倒入平皿。（2 ）平板劃線通過劃線使樣品在平板上形成單個菌落。 連續(xù)劃線法用于稀釋液

6、（見下圖右） 分區(qū)劃線法用于較濃的菌樣（本實驗細(xì)菌、酵母菌、放線菌采用此方法，下圖左）注意：接種環(huán)勿劃破培養(yǎng)基，劃線不宜重疊，要疏密適中。4.2.4平板點植接種法此法適用于觀察霉菌的菌落特征（見下圖）。用接種環(huán)蘸少許無菌生理鹽水，挑取斜面上少量菌絲或孢子，以三個角三點的形式輕輕點種于平板培養(yǎng)基上。接種時最好倒置平皿， 以免霉菌孢子飛揚。4.3液體接種法多用于增菌液進(jìn)行增菌培養(yǎng)，也可用純培養(yǎng)菌接種液體培養(yǎng)基進(jìn)行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同，僅將不同點介紹如下：由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并

7、輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。如接種霉菌菌種時，若用接種環(huán)不易挑起培養(yǎng)物時，可用接種鉤或接種鏟進(jìn)行。由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時，可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。接種液體培養(yǎng)物時應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他 器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈。凡吸過菌 液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)。4.4穿刺接種法此法多用于半固體、 醋酸鉛、三糖鐵瓊脂與明膠培養(yǎng)基的接種，操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。但必須使用筆直的接種針，而不能使用接種環(huán)。接種

8、柱狀高層或半高層斜面培養(yǎng)管時， 應(yīng)向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結(jié)果。4.5固體接種法普通斜面和平板接種均屬于固體接種，斜面接種法已講了， 不再贅述。固體接種的另一種形式是接種固體曲料，進(jìn)行固體發(fā)酵。按所用菌種或種子菌來源不同可分為：用菌液接種固體料，包括用菌苔刮洗制成的菌懸液和直接培養(yǎng)的種子發(fā)酵液。接種時按無菌操作將菌液直接倒入固體料中， 攪拌均勻。但要注意接種所用水容量要計算在固體料總加水量之內(nèi)，否則會使接種后含水量加大，影響培養(yǎng)效果。用固體種子接種固體料。包括用孢子粉、菌絲孢 子混合種子菌或其他固體培

9、養(yǎng)的種子菌。將種子菌于無菌條件下直接倒入無菌的固體料中即可，但必須充分?jǐn)嚢枋怪旌暇鶆?。一般是先把種子菌和少部分固體料混勻后再拌大堆料。二、形態(tài)與菌落特征觀察1目的要求（1） 觀察并描述出細(xì)菌、酵母菌、放線菌、真菌的平板菌落特征（群體形態(tài)）。（2）了解其菌落在其形態(tài)學(xué)鑒定上的重要性。（3 ）了解觀察酵母菌、放線菌、常見霉菌形態(tài)特征（個體形態(tài)）的基本方法。2基本原理（1）各種細(xì)菌在平板上形成的菌落均具有一定特征，其菌落一般較濕潤、光滑、透明、易挑起、菌落正反面及邊緣、中央部位的顏色一致，且菌落質(zhì)地較均勻等，菌落往往較小，較薄且有“細(xì)膩”感。它對細(xì)菌的分類、鑒定有重要的意義。（2） 酵母菌菌落一般

10、亦較濕潤、光滑、易挑起、菌落正反面及邊緣、中央部位的顏色一致， 但其菌落一般比細(xì)菌大、厚而且透明度較差。酵母菌是多形的、不運動的單細(xì)胞微生物， 細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)已有明顯的分化，菌體比細(xì)菌大，一般成圓形、橢圓形、柱形和藕節(jié)形等。本實驗用水一碘液浸片來觀察生活的酵母形 態(tài)。（3）放線菌菌落局限生長，小而薄，多為圓形，邊緣有輻射狀，外觀呈干燥、不透明的絲狀、絨毛狀或皮革狀等特征。由于營養(yǎng)菌絲伸入培養(yǎng)基中使菌落和培養(yǎng)基連接緊密，故菌絲不易被挑起。一般情況下，菌落中心的顏色常比邊緣深，由于氣生菌絲、孢子和營養(yǎng)菌絲顏色不同，常使菌落正反面呈不同顏色。放線菌可用水浸片法在顯微鏡下觀察其形態(tài)。放線菌是由不同長短

11、的纖細(xì)的菌絲所形成的單細(xì)胞菌絲體。菌體分為兩部分，即潛入培養(yǎng)基中的營養(yǎng)菌絲（或稱基內(nèi)菌絲）和生長在培養(yǎng)基表面的氣生菌絲。有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋形、波浪形或分枝狀等。 孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲及孢子的形狀和顏色常作為分類的重要依據(jù)。（4） 霉菌的菌落大而疏松，由于孢子不同的形狀，構(gòu)造和顏色，菌落表面往往呈現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)和色澤，菌落在固體培養(yǎng)基上生長呈棉絮狀（毛霉）、蜘蛛網(wǎng)狀（根霉）、絨毛狀（曲霉）和地毯狀（青霉）。霉菌的營養(yǎng)體是分枝的絲狀體。其個體比細(xì)菌和放線菌大得多，分為基內(nèi)菌絲和氣生菌 絲。氣生菌絲中又可分化出繁殖絲。不同霉菌的繁殖菌絲可以形成不同的孢子。霉菌菌絲比較

12、粗大（菌絲和孢子的直徑達(dá)到3 10卩m）,通常是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍?？刹捎萌樗崾妓崦匏{(lán)浸片法來觀察其形態(tài)。3實驗材料3.1菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、玫瑰暗黃鏈球菌、曲霉、蕁麻青霉的平 板培養(yǎng)物。3.2培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴署葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基及咼氏1號培養(yǎng)基。3.3試劑與染色劑：0.85% 生理鹽水、革蘭氏染色用碘液、0.1%美藍(lán)染色液、乳酸石碳酸棉藍(lán)染色液、50%乙醇等。3.4儀器或其它用具：接種針、載玻片、蓋玻片、鑷子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。4操作步驟4.1菌落特征的觀察4.1.1細(xì)菌菌落的描述菌落大小：大菌落（5mm以上）、中等菌落（3-5mm）、小菌落

13、（1-2mm）、露滴狀菌落（1mm 一下）菌落形狀：圓形、放射狀、假根狀、不規(guī)則等 菌落顏色：乳白色、灰白色、金黃色、粉紅色等 菌落質(zhì)地：黏稠、脆硬等菌落表面形態(tài)：有光滑、皺褶、放射狀、根狀等菌落邊緣形態(tài)：有整齊、波狀、絲狀、鋸齒狀、裂葉狀等形態(tài)菌落隆起形態(tài)：有扁平、隆起、草帽狀、膠狀等 透明度：可分為秀明、半透明、不透明等 4.1.2酵母菌菌落形態(tài)的描述：可參照細(xì)菌 4.1.3放線菌和霉菌菌落的描述： 菌落大?。悍志窒奚L和蔓延生長，用格尺測量菌落的直徑和高度 菌落表面的形態(tài)：粗糙、同心圓、輻射狀溝紋、粉狀、絨毛狀或皮革狀、疏松或緊密、有無 水滴等。菌落顏色：菌落正面顏色（包括氣生菌絲或孢子

14、顏色）；菌落反面顏色（指營養(yǎng)菌絲顏色）； 有否水溶性色素？（色素會滲入培養(yǎng)基中，使菌落周圍的培養(yǎng)基改變顏色）。菌落的組織形狀：棉絮狀、蜘蛛網(wǎng)狀、絨毛狀和地毯狀。4.2個體形態(tài)特征的觀察4.2.1酵母菌的形態(tài)觀察水-碘液浸片法 在載破片中央加1小滴革蘭氏染色用碘液，然后在其上加 3小滴水， 取少許酵母菌苔于水-碘液中混勻，蓋上蓋玻片后鏡檢。422放線菌的形態(tài)觀察(1 )插片：在平板的一半面積劃線接種，在接種線上將蓋玻片1/2長度以45。角插入瓊脂，平板另一半先插片，然后將少量放線菌孢子接種于蓋玻片與瓊脂相接的沿線。平板倒置28 C培養(yǎng)3-5天。(2 ) 0.1%美藍(lán)染色液染色：取 1滴染液置于載玻片中央，將上述平板中的蓋玻片取出， 將有菌的一面向下以 45 °角浸于載玻片的染色液中(避免氣泡)。(3 )鏡檢：用高倍鏡觀察其單個分生孢子及其基內(nèi)菌絲。4.2.3霉菌的形態(tài)觀察(1 )制片：在干凈的載玻片上加一滴乳酸石炭