免疫學(xué)方法及其

1、第六章 第六節(jié)免疫學(xué)方法及其在中醫(yī)研究中的應(yīng)用 作者介紹。第一段簡要介紹了中醫(yī)學(xué)有關(guān)免疫學(xué)的發(fā)展歷史和貢獻(xiàn)。第二段簡要介紹了免疫學(xué)的定義、分化和與中醫(yī)藥繼承和發(fā)展的關(guān)系。定義：免疫是識別和排除抗原性異物的過程，以維持機(jī)體的生理性平衡，在多數(shù)情況下對機(jī)體具有保護(hù)作用，如其功能發(fā)生異常，則也可發(fā)生疾病。免疫學(xué)的分化：分子免疫學(xué)、免疫遺傳學(xué)、免疫化學(xué)、免疫病理學(xué)、感染免疫學(xué)、免疫藥理學(xué)、神經(jīng)免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、移植免疫學(xué)等。免疫學(xué)與中醫(yī)藥繼承和發(fā)展的關(guān)系：應(yīng)用免疫學(xué)方法來研究中醫(yī)中藥，將為中醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展作出較大貢獻(xiàn)。第三段進(jìn)一步解釋免疫的功能、功能紊亂的表現(xiàn)和與中醫(yī)藥的關(guān)系：人體免疫功能主要有

2、三種：免疫防御功能、自身穩(wěn)定功能和免疫監(jiān)視功能。（1）免疫防御功能是指機(jī)體抵抗各種病原微生物并免除毒素的毒害作用，以及抵抗各種異體抗原物質(zhì)的侵襲能力，包括非特異性免疫和特異性免疫。（2）自身穩(wěn)定功能指機(jī)體清除自身衰老及傷亡的細(xì)胞，以利于組織細(xì)胞更新、維持內(nèi)環(huán)境平衡與穩(wěn)定，亦即清除內(nèi)源性抗原（類似內(nèi)邪），以保生理功能的穩(wěn)定性。（3）免疫監(jiān)視功能是指在正常情況下，人體的T細(xì)胞能識別并殺傷體內(nèi)經(jīng)常出現(xiàn)的少量異常細(xì)胞，包括癌細(xì)胞，如果免疫功能低下，不能及時消滅突變細(xì)胞在體內(nèi)大量繁殖，即有導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。第四段，闡述了章教授的觀點(diǎn)：“正氣能驅(qū)除外邪、內(nèi)邪，維持人體健康，所以，免疫功能與其相似。正氣是由腎

3、臟的先天精氣、脾運(yùn)化的水谷之氣和肺吸入的清氣構(gòu)成，所以中醫(yī)的腎、脾、肺三臟與免疫功能關(guān)系也較大?！薄罢龤馀c肺、脾、腎關(guān)系密切，肺、脾、腎的強(qiáng)弱決定正氣盛衰。根據(jù)中醫(yī)理論，腎是根本，脾是化源，肺起敷布和輔助作用，就機(jī)體免疫功能而言，腎虛免疫功能損害最重，脾虛次之，肺虛又次之，若慢性病久病失治，由輕而重，也多肺脾腎的規(guī)律發(fā)展，從而說明了中醫(yī)臟象學(xué)說與現(xiàn)代免疫學(xué)的聯(lián)系?！钡谖宥沃v“用免疫學(xué)方法研究中醫(yī)的目的及意義”。1） 探討有關(guān)中醫(yī)理論。虛證免疫功能一般低下，且以細(xì)胞免疫功能較為明顯；實(shí)證免疫功能有亢進(jìn)趨勢，具有較大理論和實(shí)際意義。2） 闡明中醫(yī)治療機(jī)理。一些中藥能調(diào)節(jié)免疫功能：扶正固本藥促進(jìn)免疫

4、功能；祛邪藥抑制免疫、防治過敏反應(yīng)。今后的任務(wù)是進(jìn)一步闡明其作用原理，提高療效，并弄清其適應(yīng)癥（這個觀點(diǎn)十分重要，確實(shí)是中醫(yī)藥研究的方向之一）。3） 發(fā)掘開發(fā)中藥。發(fā)展促進(jìn)免疫或抑制免疫中藥，開發(fā)產(chǎn)品。4） 中西醫(yī)結(jié)合，發(fā)展中醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)。（介紹了兩個觀點(diǎn)：）a.可將中醫(yī)與免疫作為中西結(jié)合的突破口。b.弄清正氣、內(nèi)邪、外邪、虛證、實(shí)證與人體免疫功能、免疫系統(tǒng)、抗原、免疫分子等免疫理論和實(shí)際的關(guān)系，將大大有利于中醫(yī)學(xué)與免疫學(xué)的發(fā)展。一、免疫學(xué)的主要方法介紹了幾個定義：免疫學(xué)檢測方法：分為體液免疫和細(xì)胞免疫測定。（1）體液免疫測定：主要利用抗原與相應(yīng)抗體在體外發(fā)生特異性結(jié)合，并在一些輔助因子參與下

5、出現(xiàn)反應(yīng)，從而用已知抗原或抗體來測知未知抗體或抗原。此外，尚包括檢測體液中的各種可溶性免疫分子，如補(bǔ)體、免疫球蛋白、循環(huán)復(fù)合物、溶菌酶等。（2）細(xì)胞免疫測定：法是根據(jù)各種免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、K細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等）表面所具有的獨(dú)特標(biāo)志和產(chǎn)生的細(xì)胞因子等，測定各種免疫細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能，以幫助了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。進(jìn)而介紹了其延伸的內(nèi)容“免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用范圍越來越廣泛，包括傳染病、免疫性疾?。庖呷毕荨⒆陨砻庖咝约膊?、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥反應(yīng)）、腫瘤等領(lǐng)域，也可用于微量蛋白、微量分泌激素、微量藥物中抗原等的測定。中醫(yī)中藥的療效及機(jī)理、某些中醫(yī)證型與免疫功能的關(guān)系、開發(fā)中藥時

6、的動物實(shí)驗(yàn)皆可以應(yīng)用免疫學(xué)方法進(jìn)行研究觀察?！痹诮榻B具體方法的時候，請大家考慮，中醫(yī)藥研究如何應(yīng)用。（一）體液免疫檢測法講抗原與抗體在體外結(jié)合反應(yīng)的一些基本條件，和為什么叫“血清學(xué)反應(yīng)”，以及其應(yīng)用領(lǐng)域。體液免疫檢測包括：（1）抗原與抗體在體內(nèi)特異性結(jié)合反應(yīng)，出現(xiàn)吞噬、殺菌、溶菌、溶細(xì)胞、變態(tài)反應(yīng)等。（2）抗原與抗體在體外特異性結(jié)合反應(yīng)，因抗原的物理性狀及參加反應(yīng)的輔助物質(zhì)不同可，出現(xiàn)凝集、沉淀、溶解（溶菌和溶細(xì)胞）、補(bǔ)體結(jié)合、中和（中和毒素或病毒）等。體液免疫反應(yīng)需要的條件：抗原、抗體兩者分子比例合適，還須提供電解質(zhì)（0.85NaCl）、適宜的溫度（37）、酸堿度（pH7.0左右）。一般多采

7、取血清作檢測，故又稱為血清學(xué)反應(yīng)。血清學(xué)反應(yīng)既可用已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測未知的抗體以協(xié)助疾病的診斷，也可用已知抗體檢測未知抗原以鑒定病原微生物及其產(chǎn)物，有助于疾病的早期診斷。1. 凝集反應(yīng)。定義：顆粒性抗原（細(xì)菌或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)參與下形成肉眼可見的凝集物，稱之為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)的原理：抗原與抗體均帶負(fù)電荷，又皆為親水膠體，由于同種電荷的相互排斥及其分子周圍的水化膜而呈穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)抗原與抗體特異性結(jié)合時，相應(yīng)的極性基團(tuán)（羥基、氨基等）的相互吸附，破壞了水化膜，使親水膠體變成了憎水膠體；加上存在的電解質(zhì)離子會中和一部分負(fù)電荷而使抗原抗體相互凝集，形成肉眼可見的凝集物。

8、（1）直接凝集反應(yīng)。定義：直接凝集反應(yīng)指顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象。前者多為細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)成分，如細(xì)菌或紅細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)抗原。1）玻片法：多用于抗原的定性檢測。將含有已知抗體的診斷血清與待測抗原（細(xì)菌或紅細(xì)胞） 滴于玻片上混合并搖動，數(shù)分鐘后出現(xiàn)肉眼可見的凝集物即為陽性反應(yīng)。此法簡便快速，常用于鑒定細(xì)菌和血型。2）試管法：多用于抗體的定量檢測。在試管中用生理鹽水將待檢血清作系列倍比稀釋，然后加入等量已知抗原，混勻、振蕩后置37過夜，以觀察凝集現(xiàn)象。凡最高稀釋度具有明顯凝集現(xiàn)象者為該待測血清的效價（或稱滴度）。凝集效價表示血清中抗體的含量，可根據(jù)有關(guān)抗體含量高低來輔助診斷或作流

9、行病的調(diào)查，如診斷傷寒或副傷寒的肥達(dá)氏反應(yīng)。（2）間接凝集反應(yīng)。定義：間接凝集反應(yīng)指將可溶性抗原吸附于載體顆粒（如乳膠顆粒、紅細(xì)胞等）的表面，稱之為致敏顆粒，當(dāng)致敏顆粒與相應(yīng)抗體結(jié)合，即可出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。這個反應(yīng)常用于測定細(xì)菌性抗體、病毒性抗體、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體抗體及某些自身抗體（如抗核抗體、抗腎抗體、抗甲狀腺抗體等）。根據(jù)凝集反應(yīng)的原理，還有間接凝集抑制試驗(yàn)、反向間接凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)等。2沉淀反應(yīng)?？扇苄钥乖ㄍ舛舅?、血清、細(xì)菌培養(yǎng)的濾液、組織浸出液等）與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)參與下，形成沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)的抗原多為多糖、類脂、蛋白質(zhì)等。1）單向擴(kuò)散試驗(yàn)。這是一種

10、抗原定量試驗(yàn)，是可溶性抗原在含抗體的瓊脂介質(zhì)中擴(kuò)散的沉淀反應(yīng)。試驗(yàn)時，將已知抗體與融化的瓊脂混勻傾注于平皿或玻片上。瓊脂凝固后打孔，孔內(nèi)加入待檢抗原，置濕盒于室溫使其擴(kuò)散，次日觀察結(jié)果。由于抗體均勻地分布于瓊脂內(nèi)，抗原從孔中向四周擴(kuò)散，抗原抗體復(fù)合物在孔周圍形成沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑與孔中抗原濃度成正比。如事先用不同濃度的已知標(biāo)準(zhǔn)抗原作單向瓊脂擴(kuò)散，并繪制成抗原濃度與沉淀環(huán)直徑的標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可根據(jù)待檢抗原孔的沉淀環(huán)直徑從標(biāo)準(zhǔn)曲線查明其抗原含量。此法常用于檢測血清免疫球蛋白和補(bǔ)體各成分的含量。2）雙向擴(kuò)散試驗(yàn)。這是可溶性抗原與抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)散的沉淀反應(yīng)。將融化的瓊脂傾注于平皿或玻片上，瓊脂

11、凝固后打孔，抗原、抗體分別注入孔內(nèi)，置濕盒內(nèi)室溫過夜。如抗原與抗體相對應(yīng)，兩者相互擴(kuò)散可在抗原、抗體孔間呈現(xiàn)清晰的白色沉淀線，一對抗原與抗體只形成一條沉淀線，幾對抗原與抗體則形成幾條沉淀線。本法常用于定性試驗(yàn)，如檢測血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。 3）對流免疫電泳。對流電泳是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴(kuò)散。在用pH 8.6 巴比妥緩沖液配制的瓊脂板上挖出成對且平行的小孔，將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場方向，于負(fù)極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負(fù)電荷，但受瓊脂中電滲作用向負(fù)極移動，抗原和抗

12、體能較快集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的白色沉淀線。只需1小時左右即可觀察結(jié)果。此法常用于檢測血清中的乙型肝炎表面抗原與甲胎蛋白等。 3中和試驗(yàn)。特異性抗體可抑制相應(yīng)抗原物質(zhì)的活性，抗體使相應(yīng)抗原的毒性或傳染性消失的反應(yīng)為中和試驗(yàn)。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗體可使病毒失去感染性等。診斷風(fēng)濕熱的抗鏈球菌溶血毒素“O”試驗(yàn)也為一種中和試驗(yàn)。乙型溶血性鏈球菌能產(chǎn)生一種溶解人、兔紅細(xì)胞的溶血毒素“O”，該毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗體所中和而不出現(xiàn)溶血。試驗(yàn)時將病人血清與溶血毒素“O”混合，作用一段時間后加入人紅細(xì)胞，紅細(xì)胞不被溶解為陽性反應(yīng)，表示病人血清中存在抗溶血毒素“

13、O”抗體。血清抗體效價達(dá)400單位以上時提示患者曾感染乙型溶血性鏈球菌，有助于風(fēng)濕熱的診斷。4. 免疫熒光法（熒光抗體法）。是應(yīng)用熒光素染料（如異硫氰酸熒光黃等）來標(biāo)記抗體，但不影響其活性，此種抗體稱熒光抗體。用已知種類的熒光抗體浸染待檢的含有抗原的細(xì)胞或組織切片，如有相應(yīng)抗原存在，則抗原即與此種抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成復(fù)合物而粘著在細(xì)胞上，不易洗脫，在熒光顯微鏡下成為發(fā)出熒光的可見物，可達(dá)到診斷或定位的目的。1）直接法。將已知種類的熒光抗體加到待檢標(biāo)本上，作用半小時后，用緩沖液沖洗，將未結(jié)合的熒光抗體全部洗去，干燥后在熒光顯微鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)熒光表明標(biāo)本中有相應(yīng)抗原存在，是為陽性。此法的優(yōu)點(diǎn)

14、是特異性高，可應(yīng)用于早期檢查病原，如細(xì)菌、病毒等，缺點(diǎn)是每檢查一種抗原，必須制備與其相應(yīng)的熒光抗體。2）間接法。先使未標(biāo)記的已知抗體與待檢抗原作用，如待檢抗原與已知抗體相對應(yīng)，即發(fā)生特異性結(jié)合成復(fù)合物，再加入熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白（或稱抗抗體，能與抗體結(jié)合），由于抗抗體與抗原抗體復(fù)合物中的抗體相結(jié)合，在熒光顯微鏡下即能見到熒光，是為陽性。5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。本法的原理是利用酶（常用辣根過氧化物酶）標(biāo)記的抗原或抗體，以測定被檢標(biāo)本中有無相應(yīng)的抗原或抗體。有間接法、雙抗體法、競爭法三種。 現(xiàn)以間接法為例，簡述其檢測血清中抗體的基本過程。1）使已知可溶性抗原吸附于固相載體（聚苯乙烯板凹孔、聚苯乙烯管

15、等）上，孵育后沖洗去未吸附的抗原；2）加待檢血清并孵育，若血清中含有相應(yīng)抗體，即與吸附的抗原結(jié)合，再行沖洗，去除未被結(jié)合的抗體；3）加入酶標(biāo)記抗球蛋白（抗抗體），使之與抗原抗體復(fù)合物上的抗體相結(jié)合，再洗滌去除未吸附的酶標(biāo)記抗球蛋白；4）加入酶作用底物（二氨基聯(lián)苯胺，DAB），酶即能分解底物并顯色，用分光光度計(jì)檢測其顯色程度。顏色的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比。不同酶標(biāo)免疫檢測原理6溶血空斑試驗(yàn)。詳見7.13實(shí)驗(yàn)的論述。7免疫印跡技術(shù)。免疫印跡或免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)（immunoblotting或Western blot）是在Southern（1975）創(chuàng)建的DNA印跡術(shù)（Southern bl

16、otting）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型免疫生化技術(shù)。其原理是應(yīng)用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白質(zhì)樣品分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳或直接印漬方式原位轉(zhuǎn)印至固相介質(zhì)上，并保持其原有的物質(zhì)類型和生物學(xué)活性不變，然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測。由于此項(xiàng)技術(shù)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高度特異性和敏感性，方法簡便易行，標(biāo)本可以長期保存和便于比較等優(yōu)點(diǎn)。因此，問世十多年來經(jīng)過不斷改進(jìn)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為免疫學(xué)、微生物學(xué)及其它生命科學(xué)常用的一種重要研究方法。（二）細(xì)胞免疫檢測法近代免疫學(xué)廣泛采用了細(xì)胞生物學(xué)、免疫血清學(xué)、免疫標(biāo)記、免疫組化等多方面技術(shù)，

17、不斷發(fā)展和完善了一系列細(xì)胞免疫檢測技術(shù)，用于檢測各類免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志（包括抗原及受體）、細(xì)胞的活化、增殖、吞噬、殺傷功能、各種細(xì)胞因子的活性或含量等方面。這些技術(shù)為深入研究和認(rèn)識機(jī)體免疫系統(tǒng)的生理、病理改變，闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床診治提供了有用的手段。隨著細(xì)胞免疫學(xué)的迅猛發(fā)展，時有新的細(xì)胞免疫檢測技術(shù)出現(xiàn)。近年來，新發(fā)展的項(xiàng)目集中在對有關(guān)細(xì)胞因子以及細(xì)胞受體方面的檢測。在中醫(yī)中藥的研究方面，近年來也得到廣泛應(yīng)用。 1淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。人類淋巴細(xì)胞在體外與特異性抗原（如結(jié)核菌素）或非特異性有絲分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T細(xì)胞即被激活而向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。T細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程可伴隨

18、有DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，最后導(dǎo)致細(xì)胞分裂。在光學(xué)顯微鏡下可計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的淋巴母細(xì)胞數(shù)，也可用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入正在分裂的淋巴細(xì)胞，用液閃測定儀來確定摻入量以確定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢查法，稱為MTT檢測法。MTT是一種甲氮唑鹽，它是細(xì)胞線粒體脫氫酶的底物，細(xì)胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍(lán)黑色成分。該產(chǎn)物的多少與活細(xì)胞數(shù)成正比，結(jié)果可用酶標(biāo)儀（595nm）測量光密度，作為MTT法的指標(biāo)。2E-花環(huán)法。人類T細(xì)胞表面有羊細(xì)胞受體（CD2）能與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成玫瑰花樣結(jié)構(gòu)。即將分離液分離出的外周的單個核細(xì)胞懸液與羊紅細(xì)

19、胞在體外混合，經(jīng)37培養(yǎng)510分鐘后放4過夜，取細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，外周血淋巴細(xì)胞中約70%80%淋巴細(xì)胞結(jié)成花環(huán)即為T細(xì)胞，此法可用來分離T細(xì)胞。3T細(xì)胞亞群檢測。參考7.14實(shí)驗(yàn)。 4細(xì)胞毒試驗(yàn)。Tc細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞等對其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒（殺傷）作用。常用的檢測方法是51Cr（鉻）釋放法，將51Cr-Na2CrO4鹽水溶液與靶細(xì)胞（不同的細(xì)胞需不同的靶細(xì)胞，如NK細(xì)胞的靶細(xì)胞為K562），于37培養(yǎng)1小時左右，51Cr即進(jìn)入靶細(xì)胞，與胞漿結(jié)合，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，將待測細(xì)胞毒的細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞混合（比例約為50:1或100:1）

20、，靶細(xì)胞殺傷越多，釋放到上清液中的游離51Cr就越多，且不能再被其他細(xì)胞吸收，用射線測量儀檢測上清液中的cpm值，可計(jì)算出待檢細(xì)胞殺傷活性高低。細(xì)胞毒的檢測對腫瘤免疫有較大價值。5巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定。將中藥（10%斑蝥）乙醇浸出液浸漬的濾紙（1cm2大?。┲糜谑茉囌咔氨矍鼈?cè)皮膚上，45小時后取下濾紙。48小時內(nèi)皮膚局部可水泡，內(nèi)含巨噬細(xì)胞。取水泡液0.5ml加雞紅細(xì)胞懸液0.01ml，37經(jīng)30分鐘后作涂片、染色與鏡檢，計(jì)算吞噬百分率及每個巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的平均數(shù)。本試驗(yàn)有助于腫瘤病情及療效的觀察。6移動抑制試驗(yàn)。致敏淋巴細(xì)胞與其特異性抗原再次接觸時，可以產(chǎn)生移動抑制因子（MIF）。這

21、種因子可以抑制巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的移動，使之定位于局部而增強(qiáng)其免疫作用。本試驗(yàn)用來觀察受檢者淋巴細(xì)胞在體外受特異性抗原刺激后，有無MIF產(chǎn)生，以測定機(jī)體對某種抗原的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的功能。常用毛細(xì)管法做MIF試驗(yàn)，將待測的白細(xì)胞懸液裝入一端封閉的毛細(xì)管內(nèi)，加入營養(yǎng)液，37經(jīng)24h觀察結(jié)果。可看到巨噬細(xì)胞或白細(xì)胞自毛細(xì)管開口端向外移行，形成半圓形的移行圈，若在營養(yǎng)液中加入一定濃度的特異性抗原，則細(xì)胞的移行圈顯著縮小，通常用移行抑制指數(shù)表示巨噬細(xì)胞或白細(xì)胞的抑制情況。移動指數(shù)加抗原后的巨噬細(xì)胞或白細(xì)胞移動面積/不加抗原的巨噬細(xì)胞或白細(xì)胞移動面積若移動指數(shù)明顯小于1，表示機(jī)體對該抗原有特異性的細(xì)

22、胞免疫作用。 7時間分辨熒光測量技術(shù)。時間分辨熒光測量技術(shù)（time-resolved fluorometry, TrF）是一項(xiàng)新型的超微量非放射性分析技術(shù)。該技術(shù)的敏感性和特異性與放射性核素測量技術(shù)相仿，但無放射測量的弊端，故問世雖短，進(jìn)展卻極為迅速，有取代放射測量之勢。其基本原理是，當(dāng)熒光標(biāo)記用于免疫分析時，在適宜的條件下，其敏感性可高于核素。但由于被測生物樣品所用溶劑、溶質(zhì)和存在的一些微粒等的散射光、熒光、磷光及化學(xué)發(fā)光等的干擾，加之FITC等熒光物質(zhì)的激發(fā)與發(fā)射光波長的重疊，背景干擾很大，致使熒光分析的敏感性可比原有的下降1/1001/1000。 TrF則以鑭系金屬元素為示蹤物，如Eu

23、3+（銪）、Tb3+（鋱）、Sm3+（釤）等與有機(jī)螯合劑結(jié)合后，經(jīng)紫外光激發(fā)，就能產(chǎn)生特征性的熒光。這種熒光不同于傳統(tǒng)熒光物質(zhì)的發(fā)射光，其特點(diǎn)是：半衰期長，為普通熒光的103106倍；Stokes位移較大；激發(fā)光的波長范圍較寬，利于提高激發(fā)能；發(fā)射熒光帶窄，可降低背景熒光，提高分辨率；尤其是鑭系金屬元素激發(fā)的熒光具有遠(yuǎn)較背景物質(zhì)、普通熒光素所發(fā)熒光為長的衰變時間，通過每次激發(fā)后，延緩一段時間再測量等步驟，能最大限度地排除自然本底短壽命熒光及散射光的干擾。8細(xì)胞因子檢測技術(shù)。細(xì)胞因子的檢測，近年來在中醫(yī)臨床及實(shí)驗(yàn)室中已廣泛應(yīng)用。（1）IL-2的檢測。IL-2的測定，可應(yīng)用于研究淋巴細(xì)胞的活性、免

24、疫調(diào)節(jié)劑作用機(jī)制、臨床對腫瘤患者療效觀察以及預(yù)后的判斷、中醫(yī)中藥的療效及作用和機(jī)理的觀察等，也可用于中藥對實(shí)驗(yàn)動物的免疫調(diào)節(jié)作用的觀察。1）IL-2依賴T細(xì)胞株的增殖試驗(yàn)。這是目前公認(rèn)的常規(guī)方法。系利用IL-2依賴T細(xì)胞株（CTLL-2）只能在含有IL-2的培養(yǎng)液中才能維持增殖，且其增殖幅度與IL-2含量在一定范圍內(nèi)成正比的特性，通過3H-TdR摻入法測得CTLL-2細(xì)胞的增殖程度，以推知培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)所含的IL-2量。2）活化淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。先以ConA刺激BALB/c小鼠的脾臟細(xì)胞，經(jīng)一定時間后，從被刺激細(xì)胞中分離出淋巴母細(xì)胞。將待檢的IL-2樣品加入淋巴母細(xì)胞懸液共同培養(yǎng)，適時加入3H-T

25、dR，再培養(yǎng)一段時間。收集細(xì)胞，測定 3H-TdR 摻入量，可推知樣品中IL-2的含量。該法可以不用 IL-2依賴細(xì)胞株，但其實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不如上法。（2）IL-4的檢測。有關(guān)IL-4的報(bào)道，見于與IgE有關(guān)的變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究。檢測方法有B細(xì)胞增殖試驗(yàn)。取BALB/c品系小鼠的脾臟細(xì)胞，以CDC法去除T細(xì)胞，再將純化的B細(xì)胞與待檢的IL-4樣品共同孵育。適時加入 3H-TdR，再經(jīng)培養(yǎng)后收集細(xì)胞，測定3H-TdR摻入量，推知樣品IL-4含量。 （3）IL-6的檢測。臨床已將IL-6檢測用于燒傷等應(yīng)激狀態(tài)下免疫系統(tǒng)改變的觀察，以及判斷多發(fā)性骨髓瘤患者病情輕重和預(yù)后等方面?，F(xiàn)已建立的IL-6檢測方

26、法為IL-6依賴細(xì)胞株增殖試驗(yàn)。該法以含IL-6的待測標(biāo)本與IL-6依賴株（B9細(xì)胞株等）共同孵育，適時加入3H-TdR ，再培養(yǎng)一定時間后，收集細(xì)胞，測定3H-TdR 摻入量，推知標(biāo)本內(nèi)的IL-6含量。近來有些實(shí)驗(yàn)室以四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）替代放射性核素?fù)饺爰?xì)胞內(nèi)，通過細(xì)胞內(nèi)線粒體酶的作用，可在細(xì)胞內(nèi)形成藍(lán)色顆粒，然后溶解細(xì)胞，以分光光度計(jì)測量培養(yǎng)液內(nèi)藍(lán)色顆粒含量，以推測樣品內(nèi)的IL-6含量。 （4）干擾素（TNF）的檢測。TNF測定主要應(yīng)用于炎癥性疾病和感染性休克等機(jī)制的研究，也用于對腫瘤患者預(yù)后判斷及療效考核。此外，檢測器官移植者血漿與尿液內(nèi)TNF含量也可作為一種移植免疫生物學(xué)指標(biāo)和排

27、斥反應(yīng)的早期指征。目前TNF檢測方法是選取原代腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞株、小鼠纖維母細(xì)胞L929株等作為靶細(xì)胞，定量后與TNF標(biāo)本共同孵育。經(jīng)一定時間后，用顯微鏡直接觀察細(xì)胞活性，或以染料染色后鑒定細(xì)胞活性，計(jì)算出細(xì)胞毒作用百分率。以50% 細(xì)胞毒作用的效價作為TNF的抗瘤活性單位。也有在孵育后的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MTT，通過溶解細(xì)胞后，以比色法測定藍(lán)色顆粒來推知TNF的活性單位。（5）腫瘤壞死因子（IFN）的檢測。IFN測定除可確定臨床使用的IFN制劑的含量外，測定血清內(nèi)IFN水平或測定受體PHA刺激后淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN的水平，均可反映機(jī)體細(xì)胞免疫的狀態(tài)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IFN的產(chǎn)生能力和血清含量與某

28、些變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制有一定聯(lián)系，也與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。此檢測也可應(yīng)用于中藥誘生干擾素的能力，以測定中藥作用原理。測定IFN的經(jīng)典方法是細(xì)胞病變抑制法。該法系先將IFN標(biāo)本與病毒的靶細(xì)胞（如Wish細(xì)胞等）共同孵育一定時間，然后加入攻擊病毒。再經(jīng)一定時間培養(yǎng)，當(dāng)未加IFN的對照內(nèi)75%100% 的細(xì)胞出現(xiàn)病變，而未加病毒的細(xì)胞對照依然完好時，通過顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況。此時，若與某一稀釋度的IFN標(biāo)本共育的細(xì)胞仍有50% 左右不出現(xiàn)病變，則表示該稀釋度標(biāo)本內(nèi)含有保護(hù)細(xì)胞的足夠的IFN，該稀釋度即為標(biāo)本中含有的IFN效價。9細(xì)胞受體的檢測。受體是細(xì)胞表面標(biāo)志之一，通過對受體的檢測，可以了解細(xì)胞

29、的功能，并為某些疾病的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。（1）補(bǔ)體受體（CR）。CR存在于許多細(xì)胞表面，在調(diào)節(jié)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，并參與同細(xì)胞表面補(bǔ)體成分的結(jié)合。最常見的有CR1、CR2、CR3、CR4，它們存在于不同的細(xì)胞上，分別識別不同的補(bǔ)體成分。如CR1可識別C3b和C4b，存在于人的紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的B細(xì)胞上。CR1具有一系列不同的生物學(xué)活性，包括清除循環(huán)免疫復(fù)合物、對補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用及識別補(bǔ)體覆蓋的抗原等。CR2識別C3b，CR2和CR1在因子裂解滅活的C3b（iC3b）時有類似作用。CR3識別iC3b，主要存在于巨噬細(xì)胞上。CR4主要識別C3dg。在不同的疾病狀態(tài)，CR的表達(dá)出現(xiàn)

30、異常。如在胰島素依賴型糖尿病中CR1表達(dá)降低，而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中CR1則過度表達(dá)。CR1可用免疫粘附法（IAHA）檢測。先在U形底96孔板中加入不同稀釋度的熱凝聚IgG，再加入豚鼠補(bǔ)體后置37孵育30min；再加1%紅細(xì)胞懸液。室溫1h后出現(xiàn)凝集者為CR1陽性。CR1亦可用熒光激活細(xì)胞分離器進(jìn)行檢測。 （2）IL-2R和血清可溶性IL-2受體（SIL-2R）的檢測。在免疫應(yīng)答過程中，T細(xì)胞受抗原遞呈細(xì)胞遞呈的抗原和分泌的IL-1作用后，發(fā)生活化，在細(xì)胞膜表達(dá)IL-2R并分泌IL-2。因此，檢測患者體內(nèi)IL-2R+細(xì)胞數(shù)可提示T細(xì)胞的活化程度。近年來發(fā)現(xiàn)在某些疾病中，IL-2R表達(dá)異常，這種IL-2R表達(dá)的變化可用于檢測疾病的預(yù)后及考察藥物的療效。測定IL-2R的一般采用免疫組化方法，可采用直接或間接免疫熒光染色來檢測淋巴細(xì)胞表面的IL-2R，也可用標(biāo)有熒光素的特異性抗體染色細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。檢測SIL-2R常采用雙抗體夾心的ELISA方法。先用一種單抗包被96孔酶標(biāo)板，再加入待測標(biāo)本和兔抗鼠的IgG-酶結(jié)合物。加入底物后，在ELISA閱讀儀上測其OD值。二、用免疫學(xué)方法研究中醫(yī)的現(xiàn)狀自70年代以來