實(shí)驗(yàn)三單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

1、臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)二、 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理】 將適量的抗體加入瓊脂內(nèi)制成免疫瓊脂板，打孔，在孔中將適量的抗體加入瓊脂內(nèi)制成免疫瓊脂板，打孔，在孔中加入待測(cè)抗原，抗原可向四周呈輻射狀擴(kuò)散，當(dāng)抗原，抗體在加入待測(cè)抗原，抗原可向四周呈輻射狀擴(kuò)散，當(dāng)抗原，抗體在比例適宜時(shí)形成白色沉淀環(huán)比例適宜時(shí)形成白色沉淀環(huán). 沉淀環(huán)直徑與抗原含量成正比。沉淀環(huán)直徑與抗原含量成正比。用標(biāo)準(zhǔn)抗血清和已知濃度的抗原（或國際參考品）制成標(biāo)準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)抗血清和已知濃度的抗原（或國際參考品）制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過測(cè)定樣品沉淀環(huán)直徑大小，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出抗曲線。通過測(cè)定樣

2、品沉淀環(huán)直徑大小，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出抗原的含量。原的含量。本試驗(yàn)主要用于檢測(cè)標(biāo)本中各種本試驗(yàn)主要用于檢測(cè)標(biāo)本中各種Ig、補(bǔ)體的含量等，具有高靈、補(bǔ)體的含量等，具有高靈敏性，高特異性特點(diǎn)。敏性，高特異性特點(diǎn)。 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求】 掌握單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的原理、操作方法、掌握單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的原理、操作方法、 結(jié)果分析及臨床應(yīng)用結(jié)果分析及臨床應(yīng)用 【試劑與器材試劑與器材】 1. 1. 羊抗人羊抗人IgGIgG血清（兔抗人血清，購買）血清（兔抗人血清，購買） 2. 2. 標(biāo)準(zhǔn)參考血清標(biāo)準(zhǔn)參考血清( (標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)IgGIgG質(zhì)控物，購買質(zhì)控物，購買) ) 3. 3. 待檢人血清（待檢人血清（

3、IgGIgG抗原）抗原） 4. pH7.4 0.01M PBS 4. pH7.4 0.01M PBS緩沖液（或緩沖液（或NSNS） 5. 5. 瓊脂粉（制備瓊脂粉（制備1%1%免疫鹽水瓊脂液）免疫鹽水瓊脂液） 6. 6. 載玻片、打孔器、載玻片、打孔器、 3737恒溫箱、濕盒、恒溫箱、濕盒、 可調(diào)微量加樣器等可調(diào)微量加樣器等用于制作用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線【操作注意事項(xiàng)操作注意事項(xiàng)】1. 1. 制備抗體瓊脂板制備抗體瓊脂板 瓊脂溫度必須嚴(yán)格控制，溫度瓊脂溫度必須嚴(yán)格控制，溫度 太低瓊脂會(huì)凝固，太高則會(huì)影響抗體的活性太低瓊脂會(huì)凝固，太高則會(huì)影響抗體的活性2. 2. 加樣孔內(nèi)的瓊脂應(yīng)挑干凈，切不可

4、損壞孔的邊加樣孔內(nèi)的瓊脂應(yīng)挑干凈，切不可損壞孔的邊 緣，確保每孔的液面基本一致緣，確保每孔的液面基本一致3. 3. 加樣精確，不能逸出孔外，否則結(jié)果不好觀察加樣精確，不能逸出孔外，否則結(jié)果不好觀察4. 4. 加樣吸取不同每份標(biāo)本均應(yīng)更換塑料吸頭加樣吸取不同每份標(biāo)本均應(yīng)更換塑料吸頭5. 5. 檢測(cè)過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線必須與樣品同步操作檢測(cè)過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線必須與樣品同步操作6. 6. 孵育時(shí)間應(yīng)控制在孵育時(shí)間應(yīng)控制在3737，24-4824-48小時(shí)，時(shí)間太短小時(shí)，時(shí)間太短 或時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響沉淀線的形成和清晰度?；驎r(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響沉淀線的形成和清晰度。 【標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備】由實(shí)驗(yàn)教師由實(shí)驗(yàn)教

5、師 1. 1. 購買標(biāo)準(zhǔn)已知濃度的購買標(biāo)準(zhǔn)已知濃度的 人血清（人血清（IgGIgG抗原）抗原） 購買標(biāo)準(zhǔn)羊抗人（兔抗人）購買標(biāo)準(zhǔn)羊抗人（兔抗人） 抗人抗人IgG-IgG-抗體（抗血清）抗體（抗血清） 2. 2. 制備制備1%1%鹽水免疫瓊脂凝膠板（在反面一角做好標(biāo)記）鹽水免疫瓊脂凝膠板（在反面一角做好標(biāo)記） 取瓊脂粉，加取瓊脂粉，加NSNS，100ml.100ml.混勻加熱溶解成透明液體，混勻加熱溶解成透明液體， 放放5656，加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清，混勻，制板，加入標(biāo)準(zhǔn)抗血清，混勻，制板 3. 3. 制板，打孔，孔徑制板，打孔，孔徑3mm3mm，孔距，打，孔距，打5 5個(gè)孔。個(gè)孔。 4. 4. 加樣

6、：在各孔分別加不同濃度稀釋度人標(biāo)準(zhǔn)血清加樣：在各孔分別加不同濃度稀釋度人標(biāo)準(zhǔn)血清10L10L 110 110， 120120， 140140，180180， 1 :160.1 :160. 稀釋稀釋 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg ，6.25mg. 6.25mg. 濃度濃度 5. 5. 保溫反應(yīng)：將凝膠板放濕盒內(nèi)，保溫反應(yīng)：將凝膠板放濕盒內(nèi)，3737反應(yīng)反應(yīng)24h,24h,觀察結(jié)果觀察結(jié)果. . 6. 6. 用坐標(biāo)紙制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用坐標(biāo)紙制作標(biāo)準(zhǔn)曲線: :以沉淀環(huán)直徑以沉淀環(huán)直徑（m mm m）為縱坐標(biāo)為縱坐標(biāo)

7、; ; 以標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)值（以標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)值（LgLg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. .標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測(cè)定結(jié)果（實(shí)物實(shí)拍）標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品測(cè)定結(jié)果（實(shí)物實(shí)拍） 測(cè)定樣本：測(cè)定樣本： 病人血清（病人血清（ 標(biāo)本標(biāo)本 1. 25mm， 標(biāo)本標(biāo)本 2. 20mm ） 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋4 4鐘濃度，預(yù)溫鐘濃度，預(yù)溫24h24h，沉淀環(huán)直徑數(shù)據(jù)，沉淀環(huán)直徑數(shù)據(jù) 30 m m 30 m m 25 m m 25 m m 20 m m 20 m m 15 m m 15 m m 以沉淀環(huán)直徑為縱坐標(biāo)，以抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)值（以沉淀環(huán)直徑為縱坐標(biāo)，以抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度

8、的對(duì)數(shù)值（Lg） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本測(cè)得直徑，查出結(jié)果。為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本測(cè)得直徑，查出結(jié)果。 沉沉 淀淀 環(huán)環(huán) 直直 徑徑（毫米毫米） 4256738 標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋：標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相當(dāng)抗原濃度：相當(dāng)抗原濃度： 沉淀環(huán)直徑：沉淀環(huán)直徑： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值：值： 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9 【實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】 1. 制備制備1.0%免疫鹽水瓊脂液免疫鹽水瓊脂液 取瓊脂粉取瓊脂粉1.0g ，加入，加入100ml. NS，混勻加熱溶解。，混勻加熱

9、溶解。 加熱時(shí)用玻棒不斷輕輕攪拌，使成透明液體，放加熱時(shí)用玻棒不斷輕輕攪拌，使成透明液體，放56， 加入加入 1 : 2 稀釋的羊（兔）抗人血清，混勻，稀釋的羊（兔）抗人血清，混勻， 56保溫備用。保溫備用。 2. 制板：制板： 每每2人制作人制作1個(gè)凝膠板。個(gè)凝膠板。 取清潔玻片一張，在背面一角處標(biāo)記，用取清潔玻片一張，在背面一角處標(biāo)記，用5ml或或10ml 刻度吸管刻度吸管 ，每片緩慢滴加瓊脂液，待凝。，每片緩慢滴加瓊脂液，待凝。 3. 打孔：打孔： 每玻片打孔兩個(gè)，孔徑每玻片打孔兩個(gè)，孔徑3mm，孔距，孔距， 用竹簽尖將孔內(nèi)瓊脂挑出。用竹簽尖將孔內(nèi)瓊脂挑出。 4. 加樣：加樣： 用用NS

10、將血清稀釋）將血清稀釋）10l血清血清+190l,NS= 1:20 混勻混勻3次，吸出次，吸出10l + 10l NS= 1;40 向瓊脂孔內(nèi)分別加入向瓊脂孔內(nèi)分別加入:20:20， 1 : 401 : 40 稀釋血清各稀釋血清各10l 5. 保溫反應(yīng)：將瓊脂板放濕盒內(nèi)，保溫反應(yīng)：將瓊脂板放濕盒內(nèi)，37溫育溫育24-48h。 6. 測(cè)量沉淀環(huán)最大直徑，查標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量沉淀環(huán)最大直徑，查標(biāo)準(zhǔn)曲線。 計(jì)算：計(jì)算：血清血清 IgG (mg/L) =對(duì)應(yīng)的血清對(duì)應(yīng)的血清IgG含量含量（稀釋倍數(shù)）（稀釋倍數(shù)） 以沉淀環(huán)直徑為縱坐標(biāo)，以抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)值（以沉淀環(huán)直徑為縱坐標(biāo)，以抗原標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)值（L

11、g） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本測(cè)得直徑，查出結(jié)果。為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本測(cè)得直徑，查出結(jié)果。 沉沉 淀淀 環(huán)環(huán) 直直 徑徑（毫米毫米） 4256738 標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋：標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相當(dāng)抗原濃度：相當(dāng)抗原濃度： 沉淀環(huán)直徑：沉淀環(huán)直徑： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值：值： 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9AgAgAgAg【結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算】n分別量取各孔樣品沉淀環(huán)的直徑，在標(biāo)準(zhǔn)分別量取各孔樣品沉淀環(huán)的直徑，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的曲線上查出對(duì)應(yīng)的IgGIgG含量。含量。n待測(cè)血清待測(cè)血清IgGIgG含量含量(mg/L)(mg/L) IgG mg/L = IgG mg/L = 標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)結(jié)果4 4（稀釋倍數(shù)）（稀釋倍數(shù)）n參考值參考值: : 成人血清成人血清 IgG:IgG: 700-1660mg/L700-1660