超分辨成像-高婧

1、利用超分辨顯微鏡研究利用超分辨顯微鏡研究蛋白質(zhì)分布及定位蛋白質(zhì)分布及定位 報(bào)告人：高報(bào)告人：高 婧婧指導(dǎo)指導(dǎo)老師：王宏達(dá)老師：王宏達(dá) 研究員研究員單位：中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所單位：中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所20152015. . 6.6. 10 10 內(nèi)容綱要內(nèi)容綱要1. 研究背景2. EGFR的質(zhì)膜成簇分布3. EGFR成簇的調(diào)控機(jī)制4. 不同細(xì)胞周期下STAT1的胞內(nèi)定位21. 1. 研究背景研究背景光學(xué)顯微鏡的分辨極限在x-y水平方向上，PSF的FWHM約為xy0.61/NABo Huang, et al. Cell, 20103超分辨顯微鏡的簡(jiǎn)介超分辨顯微鏡的簡(jiǎn)介 利用圖樣式照

2、明實(shí)現(xiàn)超分辨成像受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)飽和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SSIM)可逆的飽和光學(xué)線性熒光躍遷顯微鏡(RESOLFT) 另一種是基于單個(gè)熒光分子的定位(直接)隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM, dSTORM)光激活定位顯微鏡(PALM)4超分辨定位顯微鏡的機(jī)理超分辨定位顯微鏡的機(jī)理van de Linde, S., et al. Chem. Biol, 20135超分辨顯微鏡的應(yīng)用超分辨顯微鏡的應(yīng)用分別用Alexa Fluor532和Alexa Fluor647雙標(biāo)微管，進(jìn)行雙色dSTORM成像 A. Lampe, et.al, Biol. Cell, 201262.EGFR2.EGFR

3、的質(zhì)膜成簇分布的質(zhì)膜成簇分布 表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor, EGFR）是一種主要定位于細(xì)胞膜的跨膜受體酪氨酸激酶，其配體是EGF生長(zhǎng)因子家族的成員，比如EGF或TGF。Citri, A. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 20067促進(jìn)DNA合成和細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞遷移、存活、黏附以及抗凋亡等生命過(guò)程 EGFR結(jié)構(gòu)及其激活過(guò)程結(jié)構(gòu)及其激活過(guò)程Endres NF, et. al., Curr. Opin. Struct. Biol., 20118EGFR質(zhì)膜上成簇分布質(zhì)膜上成簇分布EGFR蛋白以Alexa

4、647偶聯(lián)的Cetuximab單抗標(biāo)記標(biāo)尺：10 mLCNL 人肺癌細(xì)胞 (LC) 正常肺上皮細(xì)胞 (NL)910COS-7細(xì)胞上細(xì)胞上EGFR分布分布標(biāo)尺：10 m11小結(jié)小結(jié)EGFR在細(xì)胞膜上以蛋白簇的形式存在。EGFR蛋白簇在不同細(xì)胞表面的分布和形態(tài)不同，在人肺癌細(xì)胞上蛋白簇的數(shù)目比正常肺細(xì)胞上多，尺寸也更大。EGFR蛋白簇在同一種細(xì)胞的不同表面分布情況也不同，上表面形成的蛋白簇與下表面相比更多更大，而懸浮細(xì)胞膜上EGFR的簇?cái)?shù)目和尺寸則介于二者之間，表明細(xì)胞極性和外界環(huán)境因素對(duì)EGFR成簇均有影響。123. 3. EGFR成簇機(jī)理的調(diào)控成簇機(jī)理的調(diào)控EGFR蛋白簇與脂筏共定位蛋白簇與脂

5、筏共定位標(biāo)尺： 10 m 和 200 nm13MCD破壞脂筏影響破壞脂筏影響EGFR蛋白簇蛋白簇標(biāo)尺：10 m14apical basalPIP2參與調(diào)控參與調(diào)控EGFR蛋白簇形成蛋白簇形成dSTORM與PALM雙色成像COS-7細(xì)胞膜上PIP2與EGFR簇EGFR：Alexa647偶聯(lián)Cetuximab標(biāo)記PIP2: PH-PLC-mEos3.2標(biāo)記標(biāo)尺： 10 m 和 200 nmEGFRPIP212315水解水解PIP2抑制抑制EGFR蛋白簇形成蛋白簇形成CtrlSJ2標(biāo)尺： 10 m16JM區(qū)與區(qū)與PIP2的結(jié)合介導(dǎo)的結(jié)合介導(dǎo)EGFR成簇成簇WTPMDM標(biāo)尺： 10 m293T cel

6、l1718離子型蛋白離子型蛋白-磷脂相互作用介導(dǎo)的磷脂相互作用介導(dǎo)的EGFR成簇模型成簇模型19小結(jié)小結(jié)雙色成像顯示EGFR與脂筏共定位，表明脂筏在EGFR成簇中起一定作用。酸性磷脂PIP2參與介導(dǎo)了EGFR蛋白簇的形成。EGFR富含正電荷氨基酸殘基的近膜區(qū)(JM區(qū))通過(guò)結(jié)合PIP2分子與質(zhì)膜相互作用，在EGFR成簇和信號(hào)激活過(guò)程中有重要作用。204.4.不同細(xì)胞周期下不同細(xì)胞周期下STAT1的胞內(nèi)定位的胞內(nèi)定位STAT 簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介Signal transducer and activator of transcription 信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員：STAT1, STAT2, STAT

7、3, STAT4, STAT5A, STAT5B和STAT6蛋白結(jié)構(gòu)和功能域：N端保守序列(ND)、卷曲結(jié)構(gòu)域(COILED COIL)、DNA結(jié)合區(qū)(DNA)、涉及轉(zhuǎn)錄的連接區(qū)(LD)、SH2結(jié)構(gòu)域(SH2)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TAD)；所有STAT蛋白均有Tyr磷酸化位點(diǎn)，STATs 1, 3, 4, 5A和5B還有Ser磷酸化位點(diǎn)。Horvath, C. M., et.al, TiBS, 200021STAT入核過(guò)程入核過(guò)程Reich, N. C., et.al, Nat. Rev. Immunol., 2006 生長(zhǎng)因子/細(xì)胞因子與受體結(jié)合STAT被JAK或PTK磷酸化聚合為同源或異源二聚體

8、進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因特定位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄22 發(fā)育、增殖、免疫、存活發(fā)育、增殖、免疫、存活細(xì)胞周期和同步化處理細(xì)胞周期和同步化處理胸腺嘧啶核苷(TdR)雙阻斷法，使細(xì)胞處于G1/S期交界處，不同時(shí)間點(diǎn)收集即得不同周期的細(xì)胞 細(xì)胞周期概念圖 細(xì)胞同步化 23STAT1在間期細(xì)胞內(nèi)的分布在間期細(xì)胞內(nèi)的分布標(biāo)尺：10 m 和 2 m24刺激前 加EGF刺激使其入核STAT1在分裂期細(xì)胞內(nèi)的分布在分裂期細(xì)胞內(nèi)的分布前期中期后期末期標(biāo)尺：10 m25不同細(xì)胞周期下不同細(xì)胞周期下STAT1的胞內(nèi)定位的胞內(nèi)定位a.不同周期下STAT1蛋白水平變化b. 核內(nèi)與胞質(zhì)內(nèi)STAT1蛋白數(shù)目比率變化c.蛋白免疫印跡檢測(cè)STAT1蛋白水平26STAT1蛋白簇特征分析蛋白簇特征分析簇?cái)?shù)目簇尺寸27小結(jié)小結(jié)在細(xì)胞周期各個(gè)階段，整個(gè)細(xì)胞內(nèi)都有STAT1的蛋白簇，推測(cè)為STAT1寡聚體或與其他家