重組人干擾素-β制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1、    重組人干擾素-制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究        摘要目的： 通過對重組IFN-的質(zhì)量研究和實驗方法參數(shù)的選擇，建立重組IFN-的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法： 通過采用細(xì)胞病變抑制法，以IFN-國家標(biāo)準(zhǔn)品、WHO的IFN-國際標(biāo)準(zhǔn)品作為參考品測定樣品的含量，比較Lowry法、BCA法測定IFN-的蛋白濃度，采用鱟試劑法檢測內(nèi)毒素含量，按照中國生物制品規(guī)程的有關(guān)要求進(jìn)行其他項目的測定。結(jié)果： 結(jié)果表明可用IFN-標(biāo)準(zhǔn)品和IFN-標(biāo)準(zhǔn)品測定IFN-的生物活性，用Lowry法測定的蛋

2、白濃度與實際值基本一致，鱟試劑法可用于制品細(xì)菌內(nèi)毒素含量的測定。國內(nèi)生產(chǎn)的重組IFN-制品達(dá)到了國家有關(guān)規(guī)定的要求。結(jié)論： 建立了重組IFN-的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并可以有效地控制制品的質(zhì)量，為我國重組IFN-的研制及臨床研究打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞-干擾素； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 基因工程中國書資料分類法分類號Quality Specification for Recombinant IFN-Liu Changnuan, Zhang Yi， Rao Chunming, Lin Jianwei, Gao Kai， Zhang Mingfang， Wang Junzhi(National Institute for the

3、 Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050)AbstractObjective: To investigate the quality and optimizing test methods and establish the quality specifications for recombinant IFN- preparation. Methods: The bioactivity of IFN- against national standard of IFN- or international

4、standard of IFN- was assayed by the method of cell pathological effect. The Lowry's method and BCA for determination of protein content was compared. The bacterial endotoxin was detected by LAL assay. Other tests were carried out according to the National Requirements for Biological Products. Re

5、sults: The bioactivity of IFN- can be measured by CPE using both IFN- or IFN- as the standard. The accuracy of Lowry's method is suitable for protein content determination. LAL assay is useful for endotoxin titration. The quality of recombinant IFN- preparation produced domestically can meet the

6、 related requirements. Conclusion: The specification for recombinant IFN- preparation is established and can be used for the quality control of the product.Key wordsInterferon-; quality specification; recombinant 人干擾素（IFN-）除具有干擾素所有的抗病毒感染、抗腫瘤作用外還有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。其基因位于人第9號染色體上，與干擾素（IFN-）的基因連鎖在一起，基因內(nèi)部不含內(nèi)含子。天

7、然人干擾素是一種由166個氨基酸組成的分子量為20 kD的糖蛋白，分子中有一個糖基化位點。體內(nèi)主要由RNA病毒和天然或人工合成的雙股RNA誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞后分泌產(chǎn)生。雖然其與IFN-只有20%的同源性，但其識別的受體與IFN-相同并具有相似的生物學(xué)活性13。天然的干擾素分子中含有3個半胱氨酸，分別在17,31和141位，第31 和141位的半胱氨酸之間形成的二硫鍵對干擾素的生物學(xué)活性非常重要。體外研究發(fā)現(xiàn)，第17位的半胱氨酸對干擾素的分子空間結(jié)構(gòu)無明顯作用，用其他的氨基酸如絲氨酸替代后，不但對其活性無影響，反而增加了穩(wěn)定性及活性?；蚬こ讨亟M的IFN-多為17Ser-IFN-，它是將17位的半光

8、氨酸由絲氨酸取代后在大腸桿菌中表達(dá)的，它在體外能正確折疊形成具有高活性的重組17Ser-IFN-4，表觀分子量為18 kD?；蚬こ蘄FN-目前已經(jīng)FDA審批，用于治療多發(fā)性硬化癥（MS），該癥是與免疫應(yīng)答有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，IFN的治療是基于它的免疫調(diào)節(jié)作用，其中包括IFN-對IFN-合成的抑制作用，能顯著降低該疾病的惡化率。許多腫瘤細(xì)胞表面均表達(dá)IFN-受體，體外實驗表明，IFN-可直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長，因此，IFN-對某些腫瘤也有一定的治療作用5。另外，IFN-也可應(yīng)用于某些病毒感染性疾病的治療，如丙型肝炎等6。由于IFN-在治療MS及病毒感染性疾病等方面的用途，目前國內(nèi)已有多家研究機

9、構(gòu)及公司開展了IFN-的研制工作。我們在對由大腸桿菌表達(dá)的重組人IFN-的檢定過程中，參照我國人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點的要求7，研究國外同類制品的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合本品的特點，在對該制品生物學(xué)活性測定、蛋白濃度測定、等電聚集檢測、內(nèi)毒素檢測等方面的進(jìn)行優(yōu)化，建立了重組IFN-的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對國內(nèi)首次生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行了質(zhì)量檢定，為國內(nèi)開展IFN-的臨床研究打下基礎(chǔ)。1材料與方法1.1主要試劑及細(xì)胞株IFN-國家標(biāo)準(zhǔn)品為本所制備；IFN-國際標(biāo)準(zhǔn)品（85/536）來自WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品實驗室（NIBSC）；Wish細(xì)胞經(jīng)本室常規(guī)傳代保存，VSV病毒為本室制備，保存于-70。1.2生物學(xué)活性測定參照文獻(xiàn)8

10、10方法進(jìn)行。將生長2448 h的Wish細(xì)胞（于含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基）配成細(xì)胞濃度約為3×105/ml的懸液，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100 l/孔。同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品對照，體積與樣品相同。在含5%CO2，37孵箱中培養(yǎng)46 h后，每孔加入4倍系列稀釋的干擾素樣品100 l，樣品稀釋用含7%小牛血清的MEM培養(yǎng)液，37培養(yǎng)1824 h。棄上清后用含3%小牛血清MEM培養(yǎng)基稀釋的VSV病毒（100TCID50）攻擊，然后于含5%CO2，37孵箱中培養(yǎng)24 h左右。棄掉培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入40 l的結(jié)晶紫液室溫染色30 min，棄掉染液，用自來水沖洗殘余的染液，用濾紙吸干后

11、每孔加入100 l的脫色液脫色，在Spectra MAX250型的自動酶標(biāo)儀上于570 nm波長處測定每孔的吸收值（OD）。分別以干擾素-國家標(biāo)準(zhǔn)品和干擾素-國際標(biāo)準(zhǔn)品的效價值在自動酶標(biāo)儀上計算樣品的效價值。1.3蛋白含量測定分別采用紫外分光光度計法、BCA蛋白濃度測定法及Lowry法測定原液中的蛋白濃度。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Pierce Inc, Rockford, Illinois, USA。按試劑盒說明書操作。1.4等電聚焦取干擾素原液0.5 ml，超濾裝置濃縮后，按文獻(xiàn)方法1011進(jìn)行等電聚焦電泳。1.5細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定由于制品中含有SDS，因此將樣品用無熱原注射用水稀釋，使

12、所含的SDS量低于0.025%后，再按照中國藥典（二部）的方法，并參照中國生物制品規(guī)程中白細(xì)胞介素-2制檢規(guī)程的要求測定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量10，12。1.6肽測定樣品對超純水透析過夜，冷凍干燥,加0.025 mol/L NH4HCO3(pH8.0)溶解，以1100加入胰蛋白酶，25處理16 h，放置4冰箱待用。樣品的分離檢測用色譜柱為Waters Symmetry C18柱，流動相A： 0.1%TFA，流動相B： 0.1%TFA乙腈，檢測波長為214 nm，梯度洗脫程序為線性梯度：070 min，流動相B從070%。1.7其它檢定項目按照中國生物制品規(guī)程2000年版的要求和方法進(jìn)行10。2

13、結(jié)果2.1生物學(xué)活性測定IFN-與IFN-均通過細(xì)胞表面的共同受體發(fā)揮作用，國外目前對IFN-的生物學(xué)活性檢測多采用VSV攻擊的Wish細(xì)胞病變法。由于目前國內(nèi)尚無IFN-國家標(biāo)準(zhǔn)品，因此我們采用IFN-國家標(biāo)準(zhǔn)品及WHO的IFN-國際標(biāo)準(zhǔn)品對國內(nèi)生產(chǎn)的重組IFN-進(jìn)行了測定。以往測定干擾素往往通過肉眼觀察細(xì)胞病變法來確定實驗結(jié)果，該方法往往會產(chǎn)生誤差，我們通過研究建立了結(jié)晶紫染色法測定干擾素效價的方法9，降低了人為因素的影響。1是用國家標(biāo)準(zhǔn)品測定IFN-效價的劑量反應(yīng)曲線，實驗結(jié)果表明，該方法具有較好的量效關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品的劑量反應(yīng)曲線具有較好的平行性，且重復(fù)性高。1重組IFN-生物學(xué)活

14、性測定的劑量反應(yīng)曲線Fig.1The dose-response curve of interferon beta我們分別用IFN-國家標(biāo)準(zhǔn)品及WIO的IFN-國際標(biāo)準(zhǔn)品對國內(nèi)生產(chǎn)的IFN-制品進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，采用上述二種標(biāo)準(zhǔn)品測定的結(jié)果無顯著性差異（P<0.05），結(jié)果見表1。表1用國家標(biāo)準(zhǔn)品和國際標(biāo)準(zhǔn)品測定IFN-的效價（IU）Tab. 1IFN- bioactivity assay demarcate with nationalIFN- standard and intional IFN- standardSampleNational IFN-standardInternat

15、ion IFN-standard12.00×1072.00×10722.91×1072.43×10732.40×1072.26×10742.66×1072.24×10753.27×1072.78×10762.90×1072.84×1072.2蛋白濃度測定蛋白濃度的測定是原液檢定過程中一項重要的指標(biāo)，蛋白濃度的高低直接影響制品純度的測定結(jié)果。目前我國多采用Lowry法檢定，該方法采用牛血清白蛋白作為蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)品，但由于不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成上存在差異，會導(dǎo)致測定結(jié)果與實際蛋白

16、濃度產(chǎn)生一定的偏差。因此我們在建立蛋白濃度測定方法時，有必要對該方法進(jìn)行驗證。我們用3種不同的方法對樣品進(jìn)行了比較測定，在分光光度法中根據(jù)IFN-的氨基酸組成計算其旋光系數(shù)用于結(jié)果校正，IFN-的A280為1.84/mg。3種不同方法測定的結(jié)果分別為A280：327 g/ml、Lowry法：352 g/ml、BCA法：543 g/ml。表明Lowry法測定值與實際值比較相符，兩組數(shù)據(jù)間無統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05），而采用BCA法測定時，蛋白濃度高于實際值（P<0.05），因此在測定蛋白濃度時宜采用Lowry法。2.3細(xì)菌內(nèi)毒素測定我們采用中華人民共和國藥典規(guī)定的限度法對樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含

17、量進(jìn)行了測定，內(nèi)毒素含量低于10 EU/ml。結(jié)果表明，該方法可用于控制制品中內(nèi)毒素的含量。另外，我們還用定量法測定了樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，利用鱟試劑與合成基質(zhì)鱟三肽的顯色反應(yīng)來定量測定內(nèi)毒素的量，結(jié)果表明，該方法的測定結(jié)果在一定范圍內(nèi)成直線關(guān)系（結(jié)果見2），直線回歸方程為y=0.0004x-0.0042，可定量測定樣品中內(nèi)毒素的含量。2.4肽測定在上述條件下，裂解后的重組IFN-蛋白可以通過C18柱得到有效的分離，測定結(jié)果表明，重組IFN-蛋白的胰酶裂解后的譜與國外同類制品的譜一致，提示具有相同的一級分子結(jié)構(gòu)。 2內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2Standard curve of endot

18、oxin by LAL assay2.5其它檢定項目按照中國生物制品規(guī)程的要求,我們對重組IFN-制品進(jìn)行了檢定。包括原液的SDS-PAGE純度分析及HPLC純度分析、N端氨基酸序列分析、免疫印跡鑒別試驗、光譜掃描分析、殘留DNA及殘余宿主菌體蛋白含量測定等。還對成品進(jìn)行了水分含量測定、家兔熱源試驗、小鼠和豚鼠異常毒性試驗等，均達(dá)到了中國生物制品規(guī)程的要求。氨基酸序列分析結(jié)果表明，大腸桿菌重組表達(dá)的IFN-, 其N端比理論上少一個蛋氨酸，與天然IFN-相同，這與蛋白表達(dá)過程中N端蛋氨酸的降解有關(guān)，與國外文獻(xiàn)報道相一致,等電點為6.58.0?？偟臋z定結(jié)果表明，我國生產(chǎn)的重組17Ser-IFN-均

19、達(dá)到了相關(guān)規(guī)定的要求。3討論生物學(xué)活性測定是生物制品質(zhì)量的關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)，由于IFN-具有廣泛的生物學(xué)活性，因此其活性測定方法也各不相同。目前國內(nèi)外大多數(shù)研究均采用VSV攻擊的Wish細(xì)胞病變法測定的抗病毒活性來表示其生物學(xué)活性和有效成分的含量。因此，在本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中我們也采用了抗病毒活性來表示IFN-的含量。在國內(nèi)目前尚無IFN-標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，利用IFN-與IFN-均通過細(xì)胞表面的共同受體發(fā)揮作用，兩者均具有相同的抗病毒生物學(xué)活性的特點，使用IFN-標(biāo)準(zhǔn)品來測定重組IFN-的生物學(xué)活性13。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用IFN-國家標(biāo)準(zhǔn)品與IFN-國際標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果無顯著性差異，提示在缺乏IFN-標(biāo)準(zhǔn)

20、品時，也可采用IFN-標(biāo)準(zhǔn)品來測定IFN-制品的抗病毒活性。本研究中，我們采用結(jié)晶紫染色法取代以往的肉眼觀察細(xì)胞病變法來確定結(jié)果，該方法定量準(zhǔn)確，量效關(guān)系明確，重復(fù)性較好。但在實驗中必須掌握VSV攻擊的量及作用時間，根據(jù)實驗結(jié)果我們認(rèn)為加入病毒后培養(yǎng)1824 h檢測結(jié)果為最佳。蛋白濃度的測定結(jié)果直接影響制品比活性的高低。目前我國生物制品規(guī)程中規(guī)定的lowry法采用非同質(zhì)的蛋白作為測定標(biāo)準(zhǔn)品，因此有可能由于不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成上的差異，即分子中含芳香族氨基酸的比例不同，導(dǎo)致測定的蛋白濃度與實際值產(chǎn)生一定的偏差。但本實驗的結(jié)果表明,Lowry法測定的結(jié)果與實際值間的差別不顯著（P<0.05

21、）。文獻(xiàn)報道14，根據(jù)氨基酸組成，IFN-的旋光系數(shù)為1.7。在建立蛋白濃度測定質(zhì)控規(guī)程時，可根據(jù)A280測得的吸光度計算出蛋白濃度，然后對蛋白濃度測定方法進(jìn)行驗證。本研究結(jié)果表明，采用Lowry法測定蛋白濃度較BCA法更接近實際值，因此在重組IFN-質(zhì)控時，我們采用了Lowry法來測定制品的蛋白濃度。由于IFN-蛋白具有很強的疏水性，因此在制備過程及成品中均需加入一定量的SDS，以增加其穩(wěn)定性。在測定內(nèi)毒素含量時，高濃度的SDS會干擾定性觀察，本研究中，我們根據(jù)限量測定的要求將樣品進(jìn)行一定的稀釋，在SDS的含量低于0.025%時，SDS對觀察結(jié)果不產(chǎn)生影響。另外我們還采用定量檢測試劑盒來測定

22、內(nèi)毒素的含量，發(fā)現(xiàn)其能排除肉眼觀察所帶來的誤差，可以準(zhǔn)確測定成品中內(nèi)毒素含量。根據(jù)生物制品檢定規(guī)程要求，結(jié)合本研究結(jié)果，經(jīng)過修改完善的重組IFN-質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，已達(dá)到國外同類產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這為我國重組IFN-的研制及臨床研究打下基礎(chǔ)。劉長暖,女38歲,助理研究員,主要從事重組IFN制品質(zhì)量控制研究.劉長暖（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）張翊（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）饒春明（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）林建偉（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）高凱（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）張明芳（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）王軍志

23、（中國藥品生物制品檢定所 北京100050）參 考 文 獻(xiàn)1，Arnason BG. Treatment of multiple sclerosis with interferon beta. Biomed Pharmacother， 1999， 53(8): 3442，Alam JJ. Interferon-beta treatment of human disease. Curr Opin Biotechnol， 1995， 6(6): 6883，Goodkin DE. Interferon beta-1b. Lancet, 1994， 334: 10574，The IFN beta Mu

24、ltiple Sclerosis Study Group. Interferon beta-1b is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis. . clinical results of a multicenter, ramdomized, double-blind, placebo-controlled trial. Neurology, 1993， 43: 6555，Scoponi C, Torresi U, Di Giuseppe M. Long-lasting complete remission of pulmonary metastases consequent to renal cell carcinoma obtained with interferon-beta therapy: Review of the literature and a case report. Tumori， 1995， 81(3): 2016，Alam JJ, Fox IH. Use of natural interferon-beta in the treatment of acute hepatitis C. Hepatology， 19