心肌檢測標志物_肌紅蛋白分離純化及親和配體的研究

1、第38卷第2期2006年6月東北師大學報(自然科學版)JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.38No.2June2006文章編號100021832(2006)0220114204心肌檢測標志物2,董龍3,錢海剛2,丘瑜敏21.,吉林長春130022;2.長春理工大學生命科學學院,吉林長春130022;3.吉林大學環(huán)境科學與資源學院,吉林長春130021)摘要肌紅蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有攜帶氧并將其分配到生物體各個部位的作用.研究表明,心血管病人發(fā)病早期,心臟中的肌紅蛋白會大量釋放入血,使其成為檢測急性

2、心肌梗死的良好標志物.采用HR100凝膠過濾層析和DEAE-52離子交換層析技術(shù),從豬心中對肌紅蛋白進行了分離與純化,后經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,得到了純化的肌紅蛋白,并利用Ph.D-7噬菌體展示肽庫試劑盒對肌紅蛋白特異性親和配體進行了篩選,最終得到其特異性親和配體序列,從而使其試劑盒的研制與應(yīng)用成為可能.關(guān)鍵詞肌紅蛋白;HR100;純化;肽庫篩選中圖分類號Q513+.4學科代碼1801710文獻標識碼A0引言肌紅蛋白(myoglobin,MB)是肌組織所特有的一種單肽鍵蛋白質(zhì)1,主要生物學功能是結(jié)合氧并攜帶氧,是哺乳動物肌肉中儲氧的蛋白質(zhì),在心肌中含量豐富.心肌蛋白是心肌細胞

3、胞漿蛋白,相對分子質(zhì)量為17800,它在早期心肌缺血的研究中早有報道2-3.當心肌或骨骼肌有損傷時,肌紅蛋白便釋放入血液中,使血中肌紅蛋白明顯增高.如心肌梗死發(fā)病后412h內(nèi),血清中肌紅蛋白可達高峰,48h恢復至正常水平4.因此,肌紅蛋白成為近年來測定急性心肌梗死(AMI)的一項重要生物學指標.本文對心肌蛋白的分離純化及配體篩選進行了具體研究,為其試劑盒的研制與應(yīng)用打下了基礎(chǔ),使其臨床診斷成為可能.1材料與方法1.1材料,儀器材料:新鮮豬心(市售).儀器:組織搗碎機,高速離心機,超聲波破碎儀,SL-2層析柜,紫外檢測儀,記錄儀,TH-1000梯收稿日期2005211221基金項目吉林省科技發(fā)展

4、計劃項目(20030450).作者簡介馬玉芹(1968-),女,博士研究生,副教授,主要從事環(huán)境生物學研究.第2期馬玉芹,等:心肌檢測標志物肌紅蛋白分離純化及親和配體的研究115度混合器,凝膠成像儀,電泳裝置,超凈工作臺,干燥箱,高壓滅菌鍋,移液槍,分析天平,恒溫培養(yǎng)箱等.低相對分子質(zhì)量標準蛋白(購于上海生化試劑所),Ph.D-7噬菌體展示肽庫試劑盒(購于BioLabs公司),SephacrylHR100柱料(購于鼎國試劑公司),DEAE-52柱料(購于鼎國試劑公司),其他試劑購自鼎國、北京益利試劑公司(均為分析純).1.2方法1.2.1組織提取物的制備將新鮮豬心與一定量的pH為8.5的10m

5、mol/LTris-HCl3min,然后將勻漿物于高速離心機(10000r/min)中離心,.1.2.2鹽析沉淀上清液用1mol/L7.4,10000r/min離心30min,4透析過夜.1.2.3SephacrylHR100柱,控制流動相的流速,收集相對分子質(zhì)量為1000020000的蛋白質(zhì).然后將此蛋白提取液用聚乙二醇(PEG)濃縮,并用pH值為8.5的10mmol/LTris-HCl緩沖液透析過夜.1.2.4DEAE-52柱層析將透析液上DEAE-52柱,然后采用線性梯度法進行洗脫,洗脫液為0300mmol/LNaCl和pH值為8.5的10mmol/LTris-HCl緩沖液.分別收集不同

6、峰值的蛋白組分.1.2.5SDS-PAGE電泳利用SDS-PAGE電泳對上述各步驟、不同峰值獲得的樣品分別進行鑒定,經(jīng)與標準蛋白相對照確定肌紅蛋白所在的峰,并對其進行收集,冷凍干燥后得純品肌紅蛋白.1.2.6Ph.D-7噬菌體展示肽庫篩選篩選步驟按Ph.D-7噬菌體展示肽庫試劑盒的說明進行.具體為:將噬菌體展示肽庫與包被有目的靶分子的平板共同溫育,先洗去未結(jié)合噬菌體,然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體.對洗脫的噬菌體進行擴增,然后再進行下一輪結(jié)合/擴增循環(huán),以富集可結(jié)合序列.經(jīng)3輪淘選后,通過DNA測序?qū)γ總€可結(jié)合克隆進行定性.峰1為高相對分子質(zhì)量雜質(zhì)峰;峰2為含肌紅蛋白的峰;峰3為低相對分子質(zhì)量雜質(zhì)

7、峰.圖1SephacrylHR100柱層析過程中樣品吸光度變化情況2結(jié)果與討論2.1結(jié)果2.1.1SephacrylHR100柱層析過程中洗脫液出峰情況在SephacrylHR100凝膠層析過程中,流出液隨時間延長其出峰情況如圖1所示.分別收集各峰樣品進行電泳.電泳結(jié)果表明,肌紅蛋白存在于第二個峰中.收集第二峰,走DEAE-52離子交換柱,并收集不同峰值的蛋白組分,電泳結(jié)果表明,經(jīng)離子交換后獲得了純的肌紅蛋白(見圖2).2.1.2鹽析、SephacrylHR100柱層析及DEAE-52柱層析粗提液用80%的硫酸銨鹽析沉淀后,離心去上清,對沉淀進行透析,并取樣進行電泳,結(jié)果見圖SD

8、S-PAGE電泳將粗提的樣品、經(jīng)硫酸銨處理的樣品、經(jīng)SephacrylHR100柱層析的樣品、經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析的樣品進行電泳實驗,結(jié)果見圖2.116東北師大學報(自然科學版)第38卷從圖2可知,粗提液中蛋白的種類較多(2泳道),蛋白之間不能很好分辨清楚;鹽析樣品中蛋白的種類有所減少(泳道3),電泳圖譜較清楚;SephacrylHR100凝膠樣品中蛋白只剩兩種(泳道4,樣品未濃縮);經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析后的樣品只留下一條帶,表明已經(jīng)純化得到一種蛋白,且相對分子質(zhì)量約為1780Ph.D-7噬菌體展示肽庫篩選利用Ph.D-7噬菌體展示肽庫對心肌蛋白的特異性親和配

9、體進行了三輪篩選,前兩輪為非特異性篩選,第三輪為特異性篩選,結(jié)果如下:(1)第一輪洗脫物滴度為6.5×3個/3.74×10-6;(2)5/L,收率為6.96×10-(3)第三輪洗脫物滴度為3.7×106個/L,收率為2.03×10-3.對第三輪洗脫物挑斑測序,得其特異性親和配體序列為:Arg-His-Pro-His-Leu-Val-Ser.2.2討論肌紅蛋白的相對分子質(zhì)量約為17800,等電點為6.9.根據(jù)其兩性蛋白質(zhì)性質(zhì),本實驗主要采取了鹽析、凝膠層析與離子交換層析三種分離純化方法.其中鹽析法的采用非常必要,粗提液經(jīng)80%硫酸銨沉淀后,絕大部

10、分雜蛋白會變性,但肌紅蛋白的活力沒有受到影響.經(jīng)過此步,部分雜蛋白被除去,樣液體積也大大減少,便于后續(xù)操作.凝膠層析法主要是根據(jù)凝膠的分子篩效應(yīng),將相對分子質(zhì)量大小1標準蛋白;2粗提液;3硫酸銨處理后樣品;4SephacrylHR100柱層析后樣品(未濃縮);5,6,7DEAE-52柱層析后樣品.圖2SephacrylHR100柱層析與DEAE-52柱層析電泳結(jié)果不同的蛋白質(zhì)相分離,本實驗采用的SephacrylHR100柱料理化性質(zhì)穩(wěn)定,且分離效率很高.實驗結(jié)果表明,采用此柱料分離肌紅蛋白效果較好.根據(jù)肌紅蛋白表面的電荷效應(yīng),本實驗采用DEAE-52離子交換柱料對其進行進一步純化,離子交換后

11、的電泳結(jié)果表明,利用DEAE-52純化肌紅蛋白是理想的,獲得了肌紅蛋白純品.本文利用噬菌體展示肽庫技術(shù),以純化的心肌蛋白為靶分子篩選其特異性親和配體,三輪收率逐漸提高,第三輪洗脫物測序結(jié)果專一性較強,說明利用七肽庫篩選結(jié)果較理想.3結(jié)論肌紅蛋白是第一個被確定的具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),主要生物學功能是結(jié)合氧5,是哺乳動物肌肉中儲氧的蛋白質(zhì).正常人的血液中肌紅蛋白含量很少,當心肌或骨骼肌有損傷時,肌紅蛋白便釋放入血液中,使血中肌紅蛋白明顯增高,故肌紅蛋白是用于心肌損傷檢測的標志物6.其對急性心肌梗死的檢測具有重要的診斷意義.本實驗主要是通過SephacrylHR100凝膠層析和DEAE-52離子交換

12、層析對勻漿、離心后的豬心進行分離純化,每步純化都經(jīng)過SDS-PAGE分析,結(jié)果證明,經(jīng)過一系列分離純化步驟可以得到電泳純的肌紅蛋白.噬菌體展示是一種體外篩選技術(shù).噬菌體展示技術(shù)使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系,使得各種靶分子(抗體、酶、細胞表面受體等)的多肽配體通過一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定7.本文以分離純化的心肌蛋白為靶分子,利用噬菌體展示隨機肽庫進行了三輪篩選,最終獲得專一性較強的親和配體,這為心肌蛋白試劑盒的臨床研制與應(yīng)用提供了可能.第2期馬玉芹,等:心肌檢測標志物肌紅蛋白分離純化及親和配體的研究117參考文獻1閔建雄.肌紅蛋白及其法醫(yī)學

13、意義探討J.法學雜志,1998(5):89-94.2KENTSP.DiffusionofmyoglobininthediagnosisofearlymyocardialischemiaJ.LabInvest,1982,46(3):265-270.3NOMOTOKI,MORIN,SHOJIT,etal.EarlylossofmyocardialmyoglobindetectedimmunohistochemicallyfollowingocclusionofthecoronaryarteryinratsJ.ExpMolPathol,1987,47(3):390-402.4賀兆發(fā),劉云寶,陸春風.

14、,1996,24:392.5孫京新,周光宏.126鄭佐婭.,3(3)7activesitesisolatedbyphagedisplayfromalibraryofrandomMol(2122.ThestudyonpurificationandaffinityligandofmyoglobinanewmakerfordetectionofAMIMAYu2qin1,ZHANGShu2hua2,FANLi2ying2,DONGLong3,QIANHai2gang2,QIUYu2min2(1.CollegeofMaterialandChemicalEngineering,ChangchunUnive

15、rsityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;2.SchoolofLifeSciences,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China;3.CollegeofEnvironmentandResources,JilinUniversity,Changchun130021,China)Abstract:Myoglobiniscomposedofahemeprostheticgroupandapolypeptidechain(globin)whichhave152

16、residues.Myoglobinexistsmainlyinmyocardium,cardiacmuscleandtheskeletalmuscle.Myoglobincanstoreandassigntheoxygentoalloverthecellandtissueofthecreature.Itisprovedrecentlythatmyo2globincanbeusedasagoodbiologicalmarkerfordetectionofacutemyocardialinfarction(AMI).Inthisthesis,obtainedmyoglobinfrombovineheartmuscleusingSephacrylHR100filtrationchromatographyandDEAE-Sephacelion-exchangechromatography.AfterSDS-PAGEgetthepureproduct.Myoglobinisasensitivemakerwhichcanbeusedindiagnosisofthe