油茶種子抗腫瘤有效部位群化學(xué)成分含量的分析方法

1、油茶種子抗腫瘤有效部位群化學(xué)成分含量的分析方法 作者：李紅冰，陳躍龍，石海峰，唐玲，馮寶民，王永奇【摘要】 目的建立準(zhǔn)確簡(jiǎn)便測(cè)量油茶種子中抗腫瘤有效部位群化學(xué)成分含量的分析方法。方法采用分光光度法。結(jié)果油茶種子60%丙酮-水提物中總皂苷純度為64.90%，總黃酮含量為11.81%，總酚含量為7.40%(其中鞣質(zhì)占2.43%)。結(jié)論分光光度法測(cè)定以上3種物質(zhì)簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性和回收率都較理想。 【關(guān)鍵詞】 油茶種子； 抗腫瘤； 總皂苷； 黃酮； 多元酚； 鞣質(zhì)Abstract：ObjectiveTo establish the accurate and convenient method

2、 for determining the contents of total saponin,total flavonoids, total polyphenol and tannin in Camellia oleifera Abel.MethodsThe contents were determined by spectrophotometry. ResultsThe contents of total saponin, total flavonoids, total polyphend and tannin were respectively 64.90%,11.81%, 7.40% a

3、nd 2.43%. ConclusionThe method is convenient and reliable for the determination of the three substances,and its reproducibility and recovery rate are fairly well.Key words：Camellia oleifera Abel.; Anti-tumor; Saponins; Flavonoids; Polyphenols; Tannin 油茶Camellia oleifera Abel屬于山茶屬山茶亞屬油茶組植物。有油茶面積3 660

4、 000 ha，年產(chǎn)油茶種子645 000 t1，資源非常豐富。但長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)油茶藥用價(jià)值方面的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。我們課題組在對(duì)油茶藥用價(jià)值進(jìn)行研究的過(guò)程中，采用MTT比色法對(duì)其種子和油粕的石油醚、乙醇、水、60%丙酮-水的梯度溶媒提取物進(jìn)行體外抗癌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明油茶種子60%丙酮-水提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞株（A549）、人胃癌細(xì)胞株(SGC7901)和人黑色素細(xì)胞瘤（A375）具有非常強(qiáng)的抑制作用。定性分析結(jié)果表明其含有大量皂苷、黃酮及多元酚類成分。為進(jìn)一步明確其抗腫瘤的有效部位及有效成分,本文對(duì)該有效部位群中的三大類成分進(jìn)行了定量分析,為抗腫瘤有效部位的分離純化提供依據(jù)。1 儀器與材料 u

5、nico7200可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；Laborata4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph公司）；BP210S十萬(wàn)分之一天平（Sartorius公司）；Jascov-560紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；油茶總皂苷對(duì)照品（湖南今漢生有限公司）；蘆丁對(duì)照品（東京化成株式會(huì)社）；沒(méi)食子酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；所用試劑均為分析純；水為蒸餾水；油茶種子（2006-03 采集于廣西壯族自治區(qū)燕洞鄉(xiāng)）。2方法與結(jié)果2.1 總皂苷的測(cè)定22.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的油茶總皂苷對(duì)照品50 mg，置100 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得濃度為0.5 mg/ml的

6、對(duì)照品溶液，備用。2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的樣品20 mg，甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，制得濃度為2.0 mg/ml的樣品溶液，備用。2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取0.8 ml的對(duì)照品溶液及樣品溶液，分置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml加塞，于60水浴中反應(yīng)15 min，取出，冰水中冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5.0 ml，搖勻立即在紫外分光光度計(jì)450700 nm波長(zhǎng)下掃描，同時(shí)空白溶液做參比，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為588 nm。2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對(duì)照品溶液 0.0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.

7、0 ml，分置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入新鮮配制的5%香草醛溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml加塞，于60水浴中反應(yīng)15 min，取出，冰水中冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5.0 ml，搖勻， 隨行做空白實(shí)驗(yàn)，588 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。得回歸方程為：Y=0.467X-0.008 2(r=0.999 9)。線性范圍為0.21.0 mg/ml。2.1.5 樣品測(cè)定精密吸取供試品溶液0.5 ml，置于具塞試管中，揮去甲醇，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中總皂苷的量，計(jì)算，即得。2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液0.5 ml置于具塞試管中，揮去甲醇，照標(biāo)準(zhǔn)

8、曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算總皂苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 總皂苷測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已知總皂苷含量的供試品溶液0.2 ml置于具塞試管中，分別加入0.5 mg/ml的油茶總皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml,揮去甲醇,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定5次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。表2 總皂苷測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.2 黃酮的含量測(cè)定32.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg，置100 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻，得濃度為0.2 mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。2.

9、2.2 供試品溶液的制備精確量取油茶60%丙酮-水提取物0.250 7 g置100 ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 ml置100 ml容量瓶中加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.501 4 mg/ml的供試品溶液。2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，用分光光度計(jì)在200600 nm區(qū)間進(jìn)行掃描。均在500 nm處有最大吸收，因此選擇500 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。測(cè)得的結(jié)果以蘆丁為基準(zhǔn)計(jì)算總黃酮的含量。2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 ml分別置于試管中，

10、各加甲醇至2.5 ml，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.25 ml，搖勻，室溫放置5min后，再加10%硝酸鋁溶液0.25 ml，搖勻，室溫放置5 min后，加入4%的氫氧化鈉溶液2.0 ml，搖勻，室溫放置15 min。以相同試劑為空白在500 nm處測(cè)吸光度（A），以A值為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.5448C+0.007 8(r=0.999 9)，線性范圍為0.034 20.163 mg/ml。2.2.5 樣品測(cè)定精密吸取供試品溶液1.5 ml置于試管中，加入甲醇至2 ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試

11、品溶液中蘆丁的量，計(jì)算，即得。1 2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液1.5 ml置于試管中，加入甲醇至2 ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，總黃酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。表3 總黃酮測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已知總黃酮含量的供試品溶液1.5 ml置于試管中，分別加入蘆丁對(duì)照品溶液0.5 ml，余下部分按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定5次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.3 多元酚及鞣質(zhì)的含量測(cè)定42.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg，置100 ml棕色

12、容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 ml，置100 ml棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.025 mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。2.3.2 供試品溶液的制備精密量取油茶種子60%g丙酮-水提取物干浸膏0.508 0 g置于200 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液20 ml。精密吸取續(xù)濾液5 ml置50 ml棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液(0.254 mg/ml)。精密吸取續(xù)濾液5 ml置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，倒入已盛有600 mg干酪素的具塞錐形瓶中，30水浴加熱1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，過(guò)濾，棄去初濾

13、液10 ml，續(xù)濾液作為供試品溶液（0.254 mg/ml），備用。2.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液和供試品溶液經(jīng)磷鉬鎢酸-碳酸鈉顯色后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在4001 000 nm區(qū)間進(jìn)行掃描。結(jié)果表明最大吸收波長(zhǎng)為754 nm，因此選擇754 nm做為測(cè)定波長(zhǎng)。測(cè)得的結(jié)果以沒(méi)食子酸為基準(zhǔn)計(jì)算總酚和鞣質(zhì)的含量。2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.5，1.0，1.5， 2.0，2.5 ml分別置于10 ml棕色量瓶中，各加水至5ml再分別加入1ml磷鉬鎢酸試液，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度。搖勻，以相同試劑為空白，30 min后在754 nm處測(cè)定吸光度（

14、A），以A值為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.3155C+0.007 9，r=0.999 8。線性范圍為0.010 70.053 2 mg/ml。2.3.5 總酚的測(cè)定精密吸取供試品溶液1.0 ml置于10 ml棕色容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法，自“加入1 ml磷鉬鎢酸試液”起，同法測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量，計(jì)算，即得。2.3.6 不被吸附的多元酚測(cè)定精密吸取供試品溶液 2.0 ml置于10 ml棕色容量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法，自“加入1 ml磷鉬鎢酸試液”起，同法測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中不被吸附的多酚的

15、量，計(jì)算，即得。 鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試品溶液 1.0 ml置于10 ml的棕色容量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算總酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表5；精密吸取供試品溶液 2 ml置于10 ml的棕色容量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸收值，平行測(cè)定5次，代入回歸方程，計(jì)算不被吸附的多酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表6。表5 總酚測(cè)定的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表6 不被吸附多酚的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精確吸取已知總酚含量的供試品溶液1 ml和 已知不被吸附的多酚含量的供試品溶液2 ml置于10 ml棕

16、色容量瓶中，分別加入0.025 mg/ml的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 ml，余下部分照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法操作，平行測(cè)定5次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表78。表7 總酚測(cè)定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表8 不被吸附多酚的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）3討論 皂苷的分析測(cè)定有多種方法，但分光光度法操作簡(jiǎn)便、靈敏，屬于經(jīng)典、成熟的方法。采用分光光度計(jì)法測(cè)定其總皂苷的含量，其結(jié)果為64.90%。 以蘆丁為對(duì)照品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系為顯色劑，利用分光光度法測(cè)定總黃酮含量，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。研究結(jié)果表明油茶種子60%丙酮-水提物種總黃酮含量為11.81%。 總酚與鞣質(zhì)含量測(cè)定方法主要是了藥典鞣質(zhì)測(cè)定方法，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品穩(wěn)定性好，干酪素吸附作用具有專屬性，操作簡(jiǎn)便，且重復(fù)性和回收率都較理想。測(cè)定結(jié)果：總酚含量為7.4