血府逐瘀膠囊對單側輸尿管梗阻大鼠Smad信號通路分子的影響

1、血府逐瘀膠囊對單側輸尿管梗阻大鼠Smad信號通路分子的影響                     作者：陸敏 周娟 陸海英 王飛 劉煜敏 張悅 【摘要】  目的探討血府逐瘀膠囊對單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所致大鼠腎間質纖維化的作用及機理。方法雄性SD大鼠34只隨機分為4組：正常組（6只）、假手術組（6只）、模型組（

2、11只）、血府逐瘀膠囊治療組（11只），采用UUO法建立大鼠腎間質纖維化模型，造模次日予以血府逐瘀膠囊灌胃治療，3周后檢測血清肌酐和尿素氮含量，觀察腎功能變化；取腎組織進行HE和六胺銀染色(periodic acid-silver metheramine, PASM)，觀察腎組織病理變化；采用Western blotting分別檢測腎組織中磷酸化Smad2（phospho-Smad2，p-Smad2），Smad2，Smad4，Smad7蛋白表達水平，觀察Smad信號通路分子表達水平的變化。結果與正常組和假手術組比較，模型組大鼠血肌酐和尿素氮含量顯著上升；腎小管基底膜明顯增厚，部分腎小管上皮細胞

3、變性，腎小管擴張與萎縮并存，腎間質明顯增寬，纖維組織增生，大量炎細胞浸潤；p-Smad2和Smad2蛋白表達顯著上調，Smad7蛋白表達顯著下調(P<0.01)，而Smad4蛋白表達水平無明顯差異。各項指標正常組與假手術組均無差異。血府逐瘀膠囊治療后，大鼠血肌酐和尿素氮含量顯著降低(P<0.05)，梗阻側腎組織病理改變明顯輕于模型組，p-Smad2和Smad2蛋白表達明顯減少(P<0.05)，而Smad7表達沒有明顯改變。結論血府逐淤膠囊可通過抑制梗阻側腎組織中Smad2蛋白的表達以及活化，減少Smad通路信號傳導，從而改善梗阻性腎病模型大鼠的腎功能和腎間質纖維化程度。 【關

4、鍵詞】  血府逐瘀膠囊 腎間質纖維化 Smad通路信號分子腎間質纖維化是各種原因所致的腎臟疾病發(fā)展至后期的共同表現(xiàn)，是導致終末期腎功能衰竭的主要原因之一。積極防治腎間質纖維化，對慢性腎臟疾病的轉歸具有重要意義。近年來的臨床資料顯示，血府逐瘀湯具有改善腎功能、防治腎纖維化發(fā)生、延緩腎功能衰竭的作用1，但其作用機制尚不明確。本實驗應用血府逐瘀膠囊對單側輸尿管梗阻（UUO）所致腎間質纖維化大鼠進行干預，觀察其療效及作用機制，為血府逐瘀膠囊防治腎間質纖維化的臨床應用提供理論依據(jù)。    1  材料與儀器    1.1

5、60; 動物  雄性SD大鼠34只，SPF級，體重160180 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(滬)2002-0002。    1.2  藥物  血府逐瘀膠囊，購自天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，主要成分為桃仁、紅花、當歸、川芎、地黃、赤芍、牛膝、柴胡、枳殼、桔梗、甘草，用時將膠囊內藥粉用蒸餾水配制成0.24 g/ml的混懸液。    1.3  試劑  血清肌酐檢測試劑盒、血清尿素氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)， BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司

6、)，兔抗大鼠磷酸化Smad2多克隆抗體（美國Chemicon公司），小鼠抗大鼠Smad2單克隆抗體（美國Cell Signaling公司），小鼠抗大鼠Smad4單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠Smad7單克隆抗體（美國R&D公司），辣根過氧化物酶耦聯(lián)的小鼠抗兔GAPDH單克隆抗體(上?？党苫瘜W生物技術公司)，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的第2抗體(晶美生物工程有限公司)，ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Pierce Pierce公司)。    1.4   儀器純水系統(tǒng)(美國Labconco)，低溫離心機(德國Eppendorf公司

7、)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀及電轉移儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像和圖像分析儀(上海復日公司)。Centrifuge 5417R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）。LeicaRM213切片機以及LeicaEG119自動包埋機（德國萊卡公司）。    2  方法    2.1  單側輸尿管梗阻動物模型的建立  大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉，呈左側臥位固定于手術板上，常規(guī)消毒，打開腹腔、腹膜，暴露并分離左側輸尿管，40縫合線在左輸尿管上1/3處兩次結扎，止血，抗感染，30縫合

8、線連續(xù)縫合關閉腹腔，間斷縫合皮膚。假手術組不結扎輸尿管，其余操作過程均相同。正常組不做任何處理。    2.2  分組與給藥  大鼠被隨機分為正常組(n=6)、假手術組(n=6)、模型組(n=11)以及血府逐瘀膠囊治療組(n=11)。治療組于術后第2天以2.4 g/（kg?d）血府逐瘀藥液灌胃，假手術組及模型組均以等量生理鹽水灌胃，正常組正常飼養(yǎng)。實驗期間動物自由進食飲水。治療21 d后殺檢，取材備用。    2.3  血清腎功能測定  分別采用苦味酸法和二乙酰-肟法測定大鼠血清肌酐以及尿素氮含

9、量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。    2.4  腎組織病理染色  取左側腎臟1/4大小組織塊，以10%中性福爾馬林緩沖液固定，經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片后分別進行HE和PASM染色。    2.5  腎組織中Smad通路信號分子蛋白表達分析  采用Western blot法。取100 mg左右腎組織置于1 ml RIPA勻漿緩沖液中勻漿，離心(12 000 r/min，10 min，4),留取上清，BCA蛋白檢測試劑盒測定裂解液蛋白濃度。按比例加入適量6×SDS上樣緩沖液，100變性5

10、min，取30 g的組織蛋白樣本經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉移至PVDF膜上(Pierce Chemical Company, USA，簡稱標本膜)。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉標本膜1 h，然后分別加入兔抗p-Smad2抗體(1500)、小鼠抗Smad2抗體(11 000)、小鼠抗Smad4抗體(1200)、小鼠抗Smad7抗體(1500)，4孵育過夜，洗膜，再與相應的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的第2抗體室溫作用1 h，充分洗滌后，用ECL試劑檢測標本膜上的信號，X-片記錄實驗結果。以計算機成像和圖像分析儀，測定X-片上雜交條帶的光密度值，代表蛋白的表達量。同一張標本膜曝光后

11、以0.5%十二烷基硫酸鈉洗脫抗體，再與GAPDH抗體(15 000)孵育雜交，作為內參照。每個實驗重復3批以上不同樣本。    2.6  統(tǒng)計學方法  采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包進行ANOVA單因素方差分析。    3  結    果    3.1  大鼠體重增長、腎臟重量變化比較見表1。造模后大鼠體重增加明顯低于正常組與假手術組(P<0.01)，治療組體重增加高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義。留取左側腎臟時發(fā)現(xiàn)，模型組與治療

12、組大鼠左側腎臟較右側明顯增大，顏色變淺，有尿液潴留，腎皮質變薄，腎盂擴張。模型組與治療組左腎腎體比及左右腎重比均顯著高于正常組與假手術組(P<0.01)，模型組與治療組無明顯差異。正常組與假手術組體重增長、左腎腎體比以及左右腎重比均無明顯差異。百事通    3.2  各組大鼠血清肌酐與尿素氮含量比較見表1。  模型組、治療組血肌酐含量顯著高于正常組和假手術組，以模型組為重，兩組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05或P<0.01）。模型組尿素氮含量顯著高于正常組、假手術組與治療組（P<0.05），治療組與正常組、假手術組比較差異

13、無統(tǒng)計學差異。正常組與假手術組比較無明顯差異。表1  各組大鼠體重增長、腎臟重量以及血肌酐、尿素氮測定結果比較與模型組比較，*P<0.05，*P<0.01；左腎腎體比為左腎重量×2與體重之比；n6    3.3  各組大鼠腎組織病理檢查結果比較見圖1。梗阻側腎組織HE染色和PASM染色可見模型組大鼠腎小管擴張，部分腎小管萎縮，腎小管上皮細胞濁腫，部分壞死與脫落，腎小管基底膜明顯增厚；腎間質明顯增寬，成纖維細胞增多，炎性細胞浸潤，纖維組織增生；皮質中腎小球數(shù)量明顯減少，腎小球形態(tài)基本正常。血府逐瘀膠囊治療組大鼠皮質中腎小球數(shù)

14、量明顯多于模型組，腎間質略有增寬，擴張與萎縮的腎小管數(shù)量少于模型組，腎小管基底膜輕度增厚，腎小管上皮細胞以變性為主，少見壞死，病變明顯輕于模型組(圖1)。    3.4  各組大鼠腎組織中Smad通路信號分子蛋白表達比較  Wsetern blot顯示，模型組腎組織中p-Smad2與Smad2蛋白表達均顯著高于正常組與假手術組(圖2，表2)，Smad7蛋白表達顯著低于正常組與假手術組(P<0.01)(圖3)。中藥血府逐瘀膠囊能明顯抑制p-Smad2與Smad2蛋白表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但對Smad7蛋白

15、表達沒有明顯影響。Smad4蛋白表達各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。p-Smad2，Smad2， Smad7蛋白表達，正常組與假手術組無明顯差異。    4  討論    單側輸尿管結扎(UUO)模型是目前國際公認的腎小管間質纖維化模型。該模型由于尿液排出受阻,腎盂及腎小管壓力增高,導致腎盂等集合管系統(tǒng)擴張,腎間質水腫,局灶性炎癥細胞浸潤,最終造成腎間質纖維化及腎萎縮。本實驗采用經(jīng)改良的大鼠腎間質纖維化模型2，觀察到UUO模型大鼠左腎腎體比、血肌酐、尿素氮含量較正常組和假手術組顯著增高，梗阻側腎組織病理染色顯示腎小管擴張

16、萎縮并存、腎小管基底膜增厚，腎間質增寬、間質炎細胞浸潤、纖維組織增生，證實單側輸尿管梗阻誘導的大鼠腎間質纖維化模型已制備成功，與文獻報道一致3,4。    腎間質纖維化是腎臟受到各種致病因素作用后，慢性損傷與修復反應反復進行的結果。根據(jù)中醫(yī)“病久入絡”“久病在血”的理論，腎間質纖維化的中醫(yī)病機可概括為氣滯血淤，淤血內停，阻滯于腎絡。血府逐瘀湯由桃紅四物湯合四逆散加桔梗、牛膝而成。全方行氣活血，化淤止痛，專為“胸中血府血淤”而設，故臨床以血府逐瘀湯加減，采用活血化瘀法治療腎纖維化，取得了滿意的療效5。本實驗應用血府逐瘀膠囊對UUO大鼠灌胃治療21 d后，觀察到治療組

17、大鼠血肌酐、尿素氮含量較模型組顯著降低，組織病理染色顯示其病理改變也明顯輕于模型組，說明血府逐瘀膠囊對梗阻性腎病的腎功能及腎間質纖維化具有明顯的改善作用。表2  各組大鼠腎組織中p-Smad2與Smad2蛋白表達比較與模型組比較，*P<0.05,*P<0.01；n=3    腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展是一個多途徑、多環(huán)節(jié)的作用過程，涉及多種細胞因子的表達調控，其中轉化生長因子-1(transforming growth factor 1, TGF-1)是國際公認的最重要的促纖維化因子之一。大量研究證實，Smad蛋白是TGF-1信號從受體到核的細

18、胞內轉導分子。Smad蛋白根據(jù)其結構和功能不同可分為3類：第1類為受體調控型Smads，包括Smad2和Smad3；第2類為Co-Smad，即Smad4；第3類為抑制型Smads，即Smad6和Smad7。Smad2和Smad3能直接被跨膜的TGF-1第1類型受體激酶磷酸化，活化的Smad2/Smad3與Smad4形成復合物轉移至核內，激活TGF-1靶基因的表達，加速腎纖維化的進展6。Smad6和Smad7是Smad信號通路中的逆向調控因子，它們可通過與磷酸化的Smad2/3結合或與活化的受體結合，直接或間接地減少Smad2/3的活化，從而阻斷Smad通路信號傳導，抑制腎間質纖維化的進展7。本

19、實驗中Western blot結果顯示，UUO模型大鼠腎組織中p-Smad2，Smad2蛋白表達較正常組和假手術組顯著上調，Smad7蛋白表達顯著下調，表明存在Smad信號通路分子的活化。血府逐瘀膠囊可明顯降低增高的p-Smad2和Smad2蛋白表達水平，但對Smad7蛋白表達影響不大，說明血府逐瘀膠囊能明顯抑制Smad2蛋白的表達和活化，從而減少Smad通路信號傳導，但這種作用不是通過上調Smad7蛋白表達實現(xiàn)的。本實驗中Smad4蛋白表達水平雖然無明顯變化，但可能存在其它因子例如Smad轉錄共抑制因子SnoN/Ski與p-Smad2競爭結合Smad4，減少活化的Smad2與Smad4異源復合物的形成的情況8。這有待于今后的實驗加以證實。    上述實驗提示，血府逐瘀膠囊抑制Smad2蛋白的表達與活化，減少TGF-1依賴的Smad信號通路的激活，可能是其抗腎間質纖維化的重要作用機制之一。【參考文獻】  1 張史昭，潘達亮，于 偉，等.腎絡瘀阻與腎纖維化關系的臨床研究J.中國中西醫(yī)結合腎病雜志,2003,4(8)：458.2 劉克劍，張 悅，李