細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察

1、實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察構(gòu)造的觀察 細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)細(xì)菌的染色和細(xì)菌細(xì)胞構(gòu)造的觀察造的觀察 目的要求目的要求 染色劑和染色的原理染色劑和染色的原理 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序 思考題思考題目的要求目的要求 學(xué)習(xí)微生物涂片學(xué)習(xí)微生物涂片 掌握細(xì)菌的一般染色發(fā)和革蘭氏染色掌握細(xì)菌的一般染色發(fā)和革蘭氏染色 進(jìn)一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)進(jìn)一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù) 觀察和識別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造觀察和識別細(xì)菌細(xì)胞的特殊構(gòu)造染色劑和染色原理染色劑和染色原理 微生物染色的基本原理，是借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。微生物染色的基本原理，是借助

2、物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作物理因素如：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。用等。 化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸引等化學(xué)因素如：正負(fù)離子之間的相互吸引等 染色劑染色劑 染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型：染料按其電離后所帶電荷的性質(zhì)可分為以下類型： 1. 酸性染料：酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。 2. 堿性染料：堿性染料：一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。紫

3、、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。 3. 中性（復(fù)合）染料：中性（復(fù)合）染料：如伊紅、美蘭等，如伊紅、美蘭等，Wright染料和染料和Gimsa染染料等（常用于細(xì)胞核染色）。料等（常用于細(xì)胞核染色）。 4. 單純?nèi)旧簡渭內(nèi)旧哼@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，這類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudan b)的染料。的染料。染色劑和染色原理染色劑和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 涂片染色用的細(xì)菌培養(yǎng)物涂片染色用的細(xì)菌培養(yǎng)物 .大腸桿菌（大腸桿菌（Es

4、cherichia coli) 24h的斜面培養(yǎng)物。的斜面培養(yǎng)物。 .枯草桿菌（枯草桿菌（Bacillus subtilis) 1216h的斜面培養(yǎng)物。的斜面培養(yǎng)物。 載玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、各種染色液、火柴、載玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、各種染色液、火柴、無菌牙簽、玻璃鉛筆、蒸餾水。無菌牙簽、玻璃鉛筆、蒸餾水。 顯微鏡、鏡頭油、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯等。顯微鏡、鏡頭油、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯等。 示范片示范片 .蘇云金芽孢桿菌（蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）的芽孢；）的芽孢； .膠質(zhì)芽孢桿菌（膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucillaginosus）

5、的莢膜；）的莢膜； .枯草芽孢桿菌的鞭毛?？莶菅挎邨U菌的鞭毛。實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序 （細(xì)菌染色的方法和步驟）（細(xì)菌染色的方法和步驟） 細(xì)菌染色的方法細(xì)菌染色的方法: . .單染色法：單染色法：用一種染色液染菌體后，就可以觀察用一種染色液染菌體后，就可以觀察微生物的大小、形狀、和細(xì)胞排列狀況，但不能鑒微生物的大小、形狀、和細(xì)胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。 . .復(fù)染色法：復(fù)染色法：用兩種或兩種以上染色液進(jìn)行染色，用兩種或兩種以上染色液進(jìn)行染色，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常有協(xié)助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗

6、酸染色法、芽孢染色法、用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法、細(xì)胞染色法等。芽孢染色法、鞭毛染色法、細(xì)胞染色法等。 染色技術(shù)的一般過程染色技術(shù)的一般過程 涂片干燥固定染色媒染脫色復(fù)染涂片干燥固定染色媒染脫色復(fù)染水洗干燥鏡檢水洗干燥鏡檢實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序 （簡單染色的方法和步驟）（簡單染色的方法和步驟） 簡單染色法（一般染色法）簡單染色法（一般染色法） .菌種：菌種：牙垢細(xì)菌牙垢細(xì)菌 .涂片涂片 .干燥：干燥：自然氣干或酒精燈自然氣干或酒精燈高處微微加熱。高處微微加熱。 固定固定 .染色：染色：在整個涂面上滴加在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色分齊氏石炭酸復(fù)紅，染色

7、分鐘鐘 。 .水洗：水洗：傾去染液，用自來傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。染料顏色為止。 干燥：干燥：空氣中自然干燥。空氣中自然干燥。 鏡檢：鏡檢：在油鏡下觀察牙垢在油鏡下觀察牙垢中的各種細(xì)菌形態(tài)并繪圖。中的各種細(xì)菌形態(tài)并繪圖。實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序 （革蘭氏染色的方法和步驟）（革蘭氏染色的方法和步驟） 革蘭氏（革蘭氏（Gram）染色法）染色法 1. 涂片涂片 2. 初染：初染：在做好的涂面上滴加在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。傾去染液，流水沖洗至無紫色。 3. 媒染：媒染：先用新配的路

8、哥氏碘先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面面1分鐘，后水洗。分鐘，后水洗。 4. 脫色：脫色：除去殘水后，滴加除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約酒精進(jìn)行脫色約30秒，后秒，后立即用流水沖洗。立即用流水沖洗。 5. 復(fù)染：復(fù)染：滴加番紅染色液，染滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 6. 鏡檢：鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。觀察染色結(jié)果并繪圖。實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序 （莢膜染色的方法和步驟）（莢膜染色的方法和步驟） 莢膜染色法（示范）：莢膜染色法（示范）：莢膜薄，易變形，莢膜薄，易變形，因此在涂片過程中不能用加熱固定。因此在涂片過程

9、中不能用加熱固定。 1. 取斜面培養(yǎng)取斜面培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌涂左右的膠質(zhì)芽孢桿菌涂片，自然干燥，自然固定。片，自然干燥，自然固定。 2. 染色：染色：在已自然晾干的涂面上，滴加在已自然晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色結(jié)晶紫染色液染色2min，以，以20%硫酸硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來水沖洗銅沖洗數(shù)次，再用自來水沖洗1次，晾干。次，晾干。 3. 鏡檢：鏡檢：油鏡觀察示范片并繪圖（菌體油鏡觀察示范片并繪圖（菌體紅色，莢膜無色）。紅色，莢膜無色）。實(shí)驗(yàn)程序?qū)嶒?yàn)程序 （鞭毛染色的方法和步驟）（鞭毛染色的方法和步驟） 菌液的制備及涂片：菌液的制備及涂片：菌種應(yīng)預(yù)先連續(xù)傳代菌種應(yīng)預(yù)先連續(xù)傳代

10、56代。代。 1. 接種：接種：先在斜面底部加入先在斜面底部加入0.51mL無菌水，取活化的枯草無菌水，取活化的枯草桿菌桿菌12環(huán)菌苔，接種于無菌水中，環(huán)菌苔，接種于無菌水中，300C 培養(yǎng)培養(yǎng)1518h。 2. 制備菌液：制備菌液：挑取斜面底部近水面處菌苔數(shù)環(huán)，移入挑取斜面底部近水面處菌苔數(shù)環(huán)，移入1mL與與菌種同溫的無菌水中，在菌種同溫的無菌水中，在280C溫箱中保溫溫箱中保溫10min。 3. 鞭毛涂片：鞭毛涂片：先用懸滴法觀察其運(yùn)動性，若運(yùn)動性很強(qiáng)，即先用懸滴法觀察其運(yùn)動性，若運(yùn)動性很強(qiáng)，即可涂片。涂片后自然干燥、固定?？赏科?。涂片后自然干燥、固定。 染色：染色：染色液必須新配制，涂片必須充分晾干才能染色。染色液必須新配制，涂片必須充分晾干才能染色。 1. 先用剛過濾的鞭毛染色液先用剛過濾的鞭毛染色液A染染7.58min左右。左右。 2. 傾去傾去A液，再加鞭毛染色液液，再加鞭毛染色液B液染液染35min，水洗，自然干，水洗，自然干燥。燥。 .用液石炭酸復(fù)紅復(fù)染用液石炭酸復(fù)紅復(fù)染min，水洗、晾干、鏡檢。，水洗、晾干、鏡檢。 油鏡下觀察鞭毛的數(shù)目及著生情況（示范鏡）并繪圖油鏡下觀察鞭毛的數(shù)目及著生情況（示范鏡）并繪圖 （菌