2018微生物檢驗技術(shù)師考點

1、 1.儀器的標識管理：紅（停用）黃（準用）綠（合格）各自所表明的狀態(tài)。2.分光光度計檢測細菌濃度用可見光分光光度計，測細菌波長用。檢測蛋白用紫外分光光度計（波長用），它也可測核酸濃度（波長）。選定分光光度計測定顏色反應(yīng)光的波長是。石英比色皿用于紫外分光光度計，玻璃比色皿用于可見光分光光度計。 3紫外透射儀 該儀器使用條件是暗室和紫外線，主要用于在紫外線下看條帶。 4色譜氣相色譜可做微生物分類和鑒定，用于微生物的化學成分分析。液相色譜儀也可做微生物化學成分分析。質(zhì)譜儀也可做微生物化學成分分析。 5測序儀蛋白測序儀測定氨基酸排列順序，測序儀是測核苷酸排列順序。能做測序的物質(zhì)是質(zhì)粒、噬菌體、產(chǎn)物。

2、6擴增儀 是聚合酶鏈反應(yīng)縮寫，能做稱擴增儀。它能以一定片段為模板，變換溫度，擴增該片段。常用的“槍”是實驗室常用的微量可調(diào)移液器。 7酶標做的儀器稱酶標儀，做反應(yīng)，其中主要設(shè)備有塑料凹孔板、洗板機和酶標儀。8.電泳類別 醋酸纖維膜電泳可用于免疫球蛋白鑒定，瓊脂免疫電泳用于蛋白分離和鑒定，對流免疫電泳可測抗原或抗體，火箭電泳測抗原量，交叉定量免疫電泳測抗原量。是等電聚焦電泳。是脈沖電場凝膠電泳，是聚丙烯酰胺凝膠電泳。9. 用于蛋白和核酸分離，原理是凝膠介質(zhì)形成立體多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩和電泳作用。分離條帶上邊是大分子，下邊是小分子物質(zhì)。過硫酸銨在制備起催化聚合作用。是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝

3、膠電泳，它用于蛋白分離，在此電泳中，丙烯酰胺濃度越大，線性分離范圍越??；該物濃度越小，線性分離范圍越大，十二烷基硫酸鈉作用是解離蛋白，用標準蛋白做標識測驗電泳條帶分子量。在中常用蛋白染料是考馬斯亮藍，硝酸銀也是其常用染料。該電泳中緩沖液重要成分為甘氨酸。 10、等電聚焦電泳 其原理是以兩性電解質(zhì)制造凝膠有不同，使帶不同電荷的多肽在電泳條件下于等電點停留。 兩性電解質(zhì)是制備該電泳凝膠不同重要物質(zhì)，用聚丙烯酰胺制備等電聚焦電泳凝膠。這種電泳主要用于蛋白質(zhì)分離。 11、脈沖電泳 脈沖電泳用于核酸分離，其優(yōu)點是分離大片段核酸。用瓊脂糖制備該電泳凝膠的介質(zhì)。這種電泳的電場為正交的交變脈沖電場。脈沖電場凝

4、膠電泳條帶靠近負極為大片段，靠近正極為小片段。染色可用溴化乙錠，也可用硝酸銀。因溴化乙錠有致癌作用，故在使用時應(yīng)注意。丙烯酰胺具有神經(jīng)毒，在用時注意個人防護。 12、瓊脂糖凝膠電泳 此電泳用于核酸分離與純化，用水平電泳槽。分離片段最佳范圍為。13、聚丙烯酰胺電泳 該電泳通常用垂直電泳槽，分離片段是最佳范圍是。 14.中華人民共和國國家標準GB 19489-2004實驗室生物安全通用要求根據(jù)生物因子對個體和群體的危害程度將其分為4級： 危害等級（低個體危害，低群體危害）不會導致健康工作者和動物致病的細菌、真菌、病毒和寄生蟲等生物因子。 危害等級（中等個體危害，有限群體危害）能引起人或動物發(fā)病，但

5、一般情況下對健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會引起嚴重危害的病原體。實驗室感染不導致嚴重疾病，具備有效治療和預防措施，并且傳播風險有限。 危害等級（高個體危害，低群體危害）能引起人或動物嚴重疾病，或造成嚴重經(jīng)濟損失，但通常不能因偶然接觸而在個體間傳播，或能用抗生素抗寄生蟲藥治療的病原體。 危害等級（高個體危害，高群體危害）能引起人或動物非常嚴重的疾病，一般不能治愈，容易直接、間接或因偶然接觸在人與人，或動物與人，或人與動物，或動物與動物之間傳播的病原體。15.保存的病原微生物菌（毒）種要按規(guī)定進行登記、上報和核準，實行雙人雙鎖管理和使用審批制度。 保存和使用各類病原微生物菌（毒）種的實驗室，應(yīng)具

6、備相應(yīng)的實驗室設(shè)備和設(shè)施條件，并在二級以上生物安全柜中操作。細菌實驗室在污染情況超過許可程度時，通常采取甲醛熏蒸消毒。病毒篇 1.用于病毒分離的材料，無論是傳代病毒培養(yǎng)物，還是采自發(fā)病或死亡動物的病料，都應(yīng)盡快送往實驗室作病毒分離或鑒定。組織細胞或動物接種和傳代可以應(yīng)用于病毒的分離和鑒定。病毒對細胞的感染性具嚴格的選擇性和特異性，因此用組織培養(yǎng)細胞接種病毒必須首先選擇敏感細胞。 （1）病毒增殖的判定：病毒在實驗動物體和組織培養(yǎng)細胞內(nèi)增殖，顯然都會影響機體和細胞的代謝和生命活動，并且經(jīng)常通過一定的形態(tài)學和病理學變化表現(xiàn)出來。 （2）細胞病變（CPE）：大部分病毒在敏感細胞系均可出現(xiàn)CPE，CPE

7、可以表現(xiàn)為嚴重的細胞破壞、細胞腫大、顆粒增多、細胞融合成合胞體或無明顯的細胞變化等。CPE經(jīng)常具有病毒“種”的特性，因此常常作為病毒鑒定的依據(jù)之一。（3）病毒蝕斑（又稱空斑）技術(shù)：病毒蝕斑是指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的純化或病毒懸液中感染病毒含量的測定。（4）病毒感染力的滴定：常用的病毒感染力的滴定有兩種方法，一種方法是用實驗動物測定LD50（半數(shù)致死量），另一種方法是在組織細胞上測定TCID50（半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量）。（5）病毒的保存：分離或鑒定后的病毒經(jīng)過冷凍干燥后可以長期保存。 2病毒形態(tài)學檢查 快速有效的標本制作技術(shù)故然重要，但更需要識別病毒結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗。

8、病毒形態(tài)學檢查方法主要有： （1）光學顯微鏡 僅用于大病毒顆粒（如痘類病毒）和病毒包涵體的檢查。 （2）電子顯微鏡檢查法 （3）超過濾法 用不同孔徑的火棉膠濾膜過濾病毒懸液，將獲得的濾液接種于組織細胞、實驗動物或雞胚，或用血凝試驗來測定病毒是否通過濾膜，從而估計病毒的大小。 （4）超速離心法 根據(jù)病毒大小的不同，其沉降速度也不同?？捎贸匐x心法測得病毒的沉降系數(shù)（S），借以計算病毒的大小。 （5）X線晶體衍射法 但標本必須為結(jié)晶，可用于無包膜病毒的研究。3免疫學鑒定 4病毒的分子生物學鑒定 分子生物學診斷的特異性取決于核酸序列的特異性，病毒的分子生物學鑒定，包括對病毒核酸和蛋白質(zhì)的測定。 核酸

9、測定主要使用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、探針技術(shù)和核酸序列測定，檢測病毒基因組中的特征性區(qū)段甚至整個病毒基因組；而蛋白質(zhì)測定可使用免疫測定技術(shù)、電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，檢測病毒特異的蛋白質(zhì)成分。 實驗動物、雞胚以及體外培養(yǎng)的器官和細胞都可以作為人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培養(yǎng)，又是病毒學實驗研究以及制備疫苗和特異性診斷試劑的先決條件。 1組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)用的玻璃器皿要求比較嚴格，要用硫酸和重酪酸鉀溶液浸泡后再清洗應(yīng)用。 常用的人工綜合營養(yǎng)液為MEM和RPMI1640。用人工綜合營養(yǎng)液配制細胞生長液時需要加入適量血清和谷氨酰胺溶液，還需要加入規(guī)定量的抗生素溶液防止細菌污染，加人碳酸氫鈉溶液修正pH，

10、根據(jù)情況還可加入HEPES溶液可使生長液具有較強的pH緩沖能力。能使組織和成片細胞分散成單個細胞的化學制劑為胰蛋白酶和EDTA，EDTA使用液又可稱之為Versen溶液，其分散細胞的作用原理是EDTA可以結(jié)合鈣、鎂離子，使組織細胞分散。動物血清中具有細胞生長所必需的各種營養(yǎng)因子，它能促進細胞的貼壁和生長，且有很強的酸堿緩沖能力。細胞培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)過程中可分為細胞生長液和細胞維持液兩種。生長液是使細胞發(fā)育增殖的液體，因此要求營養(yǎng)條件豐厚；維持液用于延緩細胞代謝，從而延長細胞的存活時間，以利于實驗的進行。這兩種液體成分的主要區(qū)別是血清含量不同。細胞生長適宜的pH范圍是pH7.27.6。細胞培養(yǎng)技

11、術(shù)全過程的關(guān)鍵是防止污染。2細胞株的保存 二甲基亞砜是細胞低溫保存的良好的保護劑，含10二甲基亞砜的血清可以作為懸浮細胞的液體在液氮中保存細胞。 3. 病毒學上常用的細胞類型可分為原代細胞、二倍體細胞和傳代細胞三大類，原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)的根本區(qū)別在于細胞是否能在體外無限傳代。 4. 細胞的純化 細胞的純化可以用細胞克隆技術(shù)?？寺∈侵赣脽o性繁殖方法產(chǎn)生的一組遺傳上相同的細胞和生物群體的過程。 分子雜交，常規(guī)的細菌篩選和各種雜交時多選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 （1）Southern雜交 被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。 （2）Northern雜交 被檢對象為RNA，探針為D

12、NA或RNA。 PCR (聚合酶鏈式反應(yīng))反應(yīng)包括三個基本步驟，即：模板DNA的變性、模板DNA與引物的退火復性、引物的延伸。PCR反應(yīng)體系包括5種基本成分，依次為：引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、 引物 引物是PCR 特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的

13、嘌呤或嘧啶核苷酸 的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR 失敗。 引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子 克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。 引物量： 每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。 2、 酶 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種

14、為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 3、 dNTP dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L， 4、模板 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋

15、白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止Rnase降解RNA。5、Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低T

16、aq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 基因芯片也稱為基因微陣列技術(shù)，指采用原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬計的靶基因或寡核苷酸片段固化于支持物表面上，產(chǎn)生探針陣列，然后與標記的樣品進行雜交，通過監(jiān)測雜交信號來實現(xiàn)對生物樣品進行快速、并行、高效檢測或醫(yī)學診斷?；蛭㈥嚵屑夹g(shù)主要包括四個基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品的準備和標記、生物分子反應(yīng)和信號的檢測及數(shù)據(jù)分析處理。 雖然基因芯片技術(shù)在微生物診斷中存在一定的不足，但還存在很大的應(yīng)用前景，其在微生物診斷中，具有以下優(yōu)越性：1）高通量，可以同時對多種微生物進行監(jiān)控。2）多條探針的分子雜交，可以有效的克服PCR

17、易被污染的特點，從而提高了特異性。3）可以克服窗口期漏檢情況的發(fā)生。特別是將其應(yīng)用于對幾種微生物的多重感染的診斷上，和鑒定新的病原微生物上，如在SARS病毒的鑒定中發(fā)揮了很大的作用。   一、DNA的復制和修復 細胞每分裂一次，染色體DNA就合成一次。DNA分子拆開成兩條鏈，每一條單鏈按照堿基配對的原則合成另一條新單鏈，成為半保留復制。在體內(nèi)DNA復制時必須有RNA引物。 二、轉(zhuǎn)錄 在生物體內(nèi)，DNA指導的RNA合成過程稱為轉(zhuǎn)錄。它是按照儲存在DNA上遺傳信息合成。合成RNA時DNA雙鏈也要解旋，解旋部位稱啟動子。 三、翻譯 在合成各種不同RNA中，tRNA具有搬運氨基酸功

18、能。構(gòu)成核糖體骨架的是rRNA，而mRNA直接決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。4種核苷酸排列組成遺傳信息，合成蛋白質(zhì)時轉(zhuǎn)換成20種氨基酸的排列順序，遺傳信息的這種轉(zhuǎn)換稱為翻譯。3個核苷酸排列順序代表一種氨基酸密碼，表示蛋白質(zhì)合成開始的密碼有一種，DNA三個終止密碼子分別是UAA、UAG、UGA。在細菌里，依靠rRNA和mRNA之間一段互補序列能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)合成開始的位置。原核生物核糖體是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA組成。在真核生物核糖體的五種主要的組蛋白中，H1在進化中最不保守。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分

19、為三類，其中類限制性內(nèi)切酶在分子克隆和微生物鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4或6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生許多一定長度的片段，使用電泳的方法分離不同長度的片段，一種DNA結(jié)構(gòu)就能形成一種特征性的圖形，稱為DNA的電泳圖譜。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。 聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5500bp）效果較好，其分辨力極高，甚至相差lbp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠通常采用垂直裝置進行電泳。 電泳完畢后，使用溴化乙

20、啶染色，DNA片段聚集的地方，在紫外光下可以顯示發(fā)橙色熒光的條帶。如果電泳中使用了已知大小的DNA片段作為分子量標志，可以測量并計算出每一DNA片段的長度。結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析將這些片段排列起來，便可作出DNA的限制性內(nèi)切酶酶切圖譜。 DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。 分子生物學基本技術(shù)知識點質(zhì)粒DNA的分離、純化和鑒定 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從1200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制

21、和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如致病的能力和對抗生素的抗性等。 細菌質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體。 從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。 抗體檢測知識點抗體檢測方法 （1） 中和反應(yīng) 中和反應(yīng)不僅測定抗體是否存在，而且測定抗體是否具有免疫保護作用，因而，盡管這種方法復雜費時，影響因素眾多而且不穩(wěn)定，在預防醫(yī)學領(lǐng)域特別是病毒性疾病中，仍然是不可取代的抗體檢測方法。 中和試驗的基本方法是，將待檢物質(zhì)與活的致病微生物混合，感染實驗動物或敏感的細胞，然后觀

22、察實驗動物是否發(fā)病、死亡，或細胞是否發(fā)生病變。在結(jié)果的解釋中應(yīng)當注意，細胞的中和試驗通常只反應(yīng)抗體阻斷病毒進入細胞的能力，這只是病毒致病過程中的一小部分。 （2） 沉淀反應(yīng) 血清蛋白質(zhì)、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這類反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)。該類反應(yīng)可檢測到202mgml水平的抗體。較常用的檢測方法有：1.單向免疫擴散 將一定量已知抗原混于瓊脂中制成瓊脂板，在適當位置打孔后將抗體加入孔中擴散，抗原抗體在擴散過程中形成以抗體孔為中心的沉淀環(huán)，可用于檢測血清中的IgG、IgM、IgA和補體C3等的含量。 2雙向免疫擴散 將抗原與抗體分別加于瓊脂凝膠中，二者自由向四周擴散，在

23、相遇處形成沉淀線?？捎糜诳贵w的定性、定量檢測。 （三）凝集反應(yīng) 細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成凝集團塊，這一類反應(yīng)稱為凝集反應(yīng)。 1直接凝集 將細菌或紅細胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細菌或紅細胞凝集現(xiàn)象。檢測方法有兩種：一是玻片凝集試驗，用于定性測抗原，多用于快速診斷；二是試管凝集試驗，在試管種系列稀釋待檢血清，加入已知顆粒抗原（死菌或活菌，多用死菌），進行的血清反應(yīng)，用于定量檢測抗體。溫箱中放24小時后取出反應(yīng)管在室溫放2個小時再判斷為宜，判定凝集滴度以凝集程度為+而定。 2間接凝集 將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表明，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象。（四）補體參加的反應(yīng)

24、 利用抗體與紅細胞上的抗原結(jié)合，激活反應(yīng)體系中的補體，導致紅細胞的溶解，用溶血現(xiàn)象作為指示系統(tǒng)幫助結(jié)果判定。常用的方法有補體結(jié)合試驗和溶血空斑試驗。（五）用標記抗原進行的抗原抗體反應(yīng) 利用熒光素、酶或放射性核素等標記物標記抗原或抗體，進行的抗原抗體反應(yīng)。靈敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等優(yōu)點。 1免疫熒光 將已知細菌、感染病毒的細胞等顆?？乖裙潭ㄓ谳d玻片，加待檢血清反應(yīng)后，再 加熒光素標記的抗抗體，置熒光顯微鏡下觀察判定，用于檢測抗體。 2 酶免疫測定 是用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。可用目測定性，也可用酶標測定儀測定光 密度（OD）值以反應(yīng)抗體的含量，敏感度可達ngml甚至pgm

25、l。常用于標記的酶有辣 根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗（EUSA）。采用雙抗體 夾心法或間接法檢測特異抗體。 3 放射免疫測定法 用放射性的核素（125I和131I）標記抗原，檢測抗體，靈敏度達pgml。 4 免疫印跡法 將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳區(qū)分的蛋白質(zhì)抗原轉(zhuǎn)移置NC或PVDF等膜 上。檢測特異的抗體。用該法檢測血清HIV抗體為診斷HIV感染的方法之一。 細胞免疫檢驗知識點淋巴細胞的分離與類型鑒定 體外檢測淋巴細胞，需要先制備外周血單個核細胞（PBMc），制備PBMC常用的方法是葡聚糖一泛影葡胺（淋巴細胞分離液）密度梯度離心法。以下方法通過檢測淋巴細胞的某

26、些表面標志，可確定細胞的不同類型。 1免疫熒光法 2磁珠分離法 3陶選法 4流式細胞術(shù) 細胞免疫檢驗知識點免疫細胞功能測定 （1） T細胞功能測定 1T細胞增殖試驗 2細胞毒試驗 （1）51Cr釋放法 （2）乳酸脫氫酶釋放法（3）皮膚試驗：根據(jù)局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強度檢測。常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風菌素等。 （二）B細胞功能測定 1B細胞增殖試驗 B細胞受絲裂原刺激后，進行分裂增殖，溫育一定時間后檢查抗體形成細胞的數(shù)目。 2抗體形成細胞測定 常用的溶血空斑試驗測定。將SRBC、待檢B細胞、補體及適量瓊脂糖液混合，傾斜平皿，溫育l3小時后，肉眼觀測分散的溶血空

27、斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個抗體形成細胞，空斑的數(shù)量即為抗體形成細胞數(shù)。 常用儀器知識點生物培養(yǎng)類 1 普通培養(yǎng)箱 分為隔水式和直熱式兩種，隔水式培養(yǎng)箱采用浸入式電熱管隔水加溫，箱內(nèi)各部溫度恒定均勻，為實驗室首選；直熱式培養(yǎng)箱是以電爐絲直接加熱，箱內(nèi)上下層溫度相差較大，指示用溫度計不能真實指示底層溫度。 用途：用于普通需氧和兼性厭氧細菌的培養(yǎng)。當室溫低時，也可用于真菌培養(yǎng)。但細菌和真菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。使用時注意事項：（1） 箱體必須有效接地，避免將水濺在內(nèi)層玻璃門上，以防玻璃受驟冷而爆裂。 （2） 隔水式培養(yǎng)箱在通電前，一定要先加水（以蒸餾水或去離子水為宜），否則會燒壞電熱管，經(jīng)常觀察水

28、位指示浮標，水位不足時，及時補足水量。 （3） 箱內(nèi)的培養(yǎng)物不宜放置過擠以利冷熱空氣對流不受阻塞，保持箱內(nèi)溫度均勻。培養(yǎng)時，打開箱體頂部的通風口，避免箱內(nèi)濕度過大。 （4） 如箱內(nèi)溫度不穩(wěn)定，可檢查溫度控制器的接點或請專人檢修。 （5）使用時應(yīng)早晚觀測箱內(nèi)溫度各一次，每次觀測后記錄箱內(nèi)實際溫度。 （5） 培養(yǎng)箱使用后要定期消毒，以免交叉污染，影響檢測結(jié)果。 2真菌培養(yǎng)箱 是氣溫過高地區(qū)培養(yǎng)霉菌和酵母菌的必備設(shè)備。配有加熱、制冷、加濕、消毒系統(tǒng)，可自動調(diào)節(jié)溫度，控制濕度、定時消毒、自動換氣等。當室溫高于35時，也可用于培養(yǎng)細菌。但真菌和細菌不可在同一培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 使用時注意事項：（1） 接通電

29、源后，打開開關(guān)，設(shè)定溫度，并用測量開關(guān)測量箱內(nèi)實際溫度。 （2） 開機一段時間后加熱和制冷兩燈均不亮，表示箱內(nèi)溫度達到平衡；如兩燈同時亮，表示機器故障，須請專業(yè)人員檢修。 （3） 在箱內(nèi)取放物品時，切勿碰撞探頭，以免影響靈敏度。 （4） 在制冷裝置啟動時，如有異常聲音，應(yīng)立即停機檢修。 （5） 儀器使用時應(yīng)每天兩次（早、晚各一次）觀測記錄箱內(nèi)實際溫度，并由使用人和保管人簽字。 （6） 每批培養(yǎng)物培養(yǎng)后，要定期對培養(yǎng)箱內(nèi)進行消毒，以免交叉污染。 3.恒溫振蕩培養(yǎng)箱 需恒溫振蕩培養(yǎng)的微生物可用此培養(yǎng)箱培養(yǎng)。其內(nèi)部有冷、熱氣流風道使箱內(nèi)氣體循環(huán)流暢，溫度比較均勻。實驗室應(yīng)根據(jù)需要選擇相應(yīng)溫度范圍和振

30、蕩頻率的培養(yǎng)箱使用。使用時注意事項：（1）設(shè)備要求工作地面平整且后部有散熱空間，切勿沖擊散熱片。（2）設(shè)備移動時要平行移動，任一方向不可傾斜大于45度。 （3）搖盤上的螺釘要經(jīng)常檢查，以免所夾物品脫落。 （4）如長期工作在“制冷”狀態(tài)時或停機三個月以上，要按期做加熱驅(qū)潮處理，每隔兩周一次。 （5）使用中定時觀測箱內(nèi)溫度和轉(zhuǎn)速，并做記錄。 （6）如發(fā)生故障，應(yīng)由專業(yè)人員檢修。 4厭氧（CO2）培養(yǎng)箱 主要用于厭氧菌、微需氧菌等的培養(yǎng)。一般由控溫、抽空、細菌過濾、細菌培養(yǎng)罐以及箱外的各種壓縮氣體鋼瓶組成。 使用時注意事項： （1）N2、CO2鋼瓶可立于箱體旁與箱體相連，H2鋼瓶應(yīng)另置安全處，以免發(fā)

31、生危險，用時用橡皮袋取出少許，與上述鋼瓶配用。 （2）作厭氧培養(yǎng)時，打開培養(yǎng)罐門，將已接種好的培養(yǎng)物放人罐內(nèi)并迅速放人催化劑鈀粒、干燥劑、亞甲基藍指示劑，關(guān)閉罐門并扭緊。 （3）打開此罐的電磁閥開關(guān)和真空泵開關(guān)，抽氣至真空度達到93.3kPa時，關(guān)閉 真空泵開關(guān)。 （4）開啟N2輸氣閥，慢慢開啟N2鋼瓶和減壓閥，使罐內(nèi)充滿N2氣，關(guān)閉N2氣，開啟真空泵抽氣，然后再用N2充氣一次。 （5）第三次按N2 80、H2 10、C0210充氣。待指針回至零位時關(guān)閉輸氣閥，再關(guān)減壓閥和電磁閥。不可出現(xiàn)負壓，影響厭氧環(huán)境。 （6）選擇所需溫度，進行培養(yǎng)。 （7）在培養(yǎng)過程中不可打開培養(yǎng)罐門。以免破壞厭氧環(huán)境

32、。 （8）使用過程中要經(jīng)常觀測培養(yǎng)箱內(nèi)溫度，并進行記錄。 常用儀器知識點顯微成像類 1.顯微鏡可分為普通光學顯微鏡和電子顯微鏡，實驗室可根據(jù)觀測項目不同選擇相應(yīng)的類型。利用光的衍射作用，以可見光為照明光源的普通光學顯微鏡的分辨極限為200nm，可觀測細菌和細胞，但對于細菌和細胞的亞結(jié)構(gòu)以及病毒，光鏡無法辨認；電鏡以電子束為照明光源，其波長極短，可有效提高其分辨率，達到0.2nm，用電磁透鏡代替玻璃透鏡。 2 暗視野顯微鏡 可分辨0.04微米的物體，微生物實驗室多用于觀察未染色標本活的細菌、真菌等，并可觀察活細胞內(nèi)的線粒體及細菌鞭毛的運動。但其只能看到物體的存在和運動，不能看清其細胞結(jié)構(gòu)。 載玻

33、片厚度為1.0mm，且載玻片和蓋玻片需清潔無劃痕；標本濃度不宜過濃。 3 熒光顯微鏡 熒光顯微鏡是利用熒光光源（紫外光）作為激發(fā)光，透過經(jīng)熒光色素染色的標本，輻射出比激發(fā)光的波長較長的熒光，經(jīng)光學系統(tǒng)放大后，可觀察其可見的熒光圖像，可分辨標本內(nèi)一些物質(zhì)的性質(zhì)與位置。 常用儀器知識點滅菌、消毒類濾菌器是利用微孔濾膜的微小孔徑通過抽濾或壓濾，將微生物阻留在濾膜上，以便進一步培養(yǎng)分析。從材質(zhì)的不同可分為玻璃濾菌器和金屬濾菌器等；從工作原理的不同可分為負壓抽濾和正壓壓濾。1 超凈工作臺 超凈工作臺是微生物實驗室通常使用的無菌操作臺，比一般的無菌操作室更潔凈其潔凈度可達百級。 超凈工作臺采用層流技術(shù)凈化

34、空氣，分為水平式和垂直式，在層流有效區(qū)內(nèi)保持無菌環(huán)境。但不能保證微生物不污染環(huán)境和操作人員。而另加一套空氣回收系統(tǒng)的生物安全凈化工作臺，可避免被檢材料污染環(huán)境和操作人員。2 生物安全柜 生物安全柜可提供樣品和工作人員的雙重保護。過濾后的潔凈氣流從安全柜頂部吹下，通過工作區(qū)域，在到工作人員的呼吸區(qū)域前被俘獲。氣流在放空前將被過濾,一般情況下過濾后的空氣將被排回實驗室。超凈工作臺提供的是對樣品的保護，對操作者和環(huán)境是不提供保護的；而生物安全柜同時提供對操作者、環(huán)境和樣品的保護。 生物安全柜可分為一級、二級和三級三大類以滿足不同的生物研究和防疫要求。 （1）一級生物安全柜可保護工作人員和環(huán)境而不保護

35、樣品。氣流原理和實驗室通風櫥一樣，不同之處在于排氣口安裝有HEPA過濾器。所有類型的生物安全柜都在排氣和進氣口使用HEPA過濾器。一級生物安全柜本身無風機，依賴外接通風管中的風機帶動氣流，由于不能保護柜內(nèi)樣品，目前已較少使用。 （2）二級生物安全柜是目前應(yīng)用最為廣泛的柜型。按照NSF49的中的規(guī)定，二級生物安全柜依照人口氣流風速、排氣方式和循環(huán)方式可分為4個級別：A1，A2，B1，B2。所有的二級生物安全柜都可提供工作人員、環(huán)境和樣品的保護。 （3）三級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設(shè)計的，柜體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作，俗稱手套箱，試驗品通過雙門的傳遞箱進出安全柜

36、以確保不受污染，適用于高風險的生物試驗。生物安全柜柜內(nèi)操作主要注意事項： A.緩慢移動原則：為了避免影響正常的風路狀態(tài)，柜內(nèi)操作時手應(yīng)該盡量平緩移動。 B.物品平行擺放原則：為了避免物品和物品之間的交叉污染現(xiàn)象產(chǎn)生，在柜內(nèi)擺放的物品應(yīng)該盡量呈橫向一字擺開，避免回風過程中造成交叉污染。同時避免堵塞背部回風隔柵影響正常風路。 C.避免震動原則：柜內(nèi)盡量避免震動儀器（例如離心機漩渦振蕩器等）的使用，因為震動會使得積留在濾膜上的顆粒物質(zhì)抖落。導致操作室內(nèi)部潔凈度降低，同時如果在前操作面平衡失敗還會引起安全柜對操作者的污染。 D.不同樣品柜內(nèi)移動原則：柜內(nèi)兩種及以上物品需要移動時，一定遵循低污染性物品向

37、高污染性物品移動原則，避免污染性高的物品在移動過程中產(chǎn)生對柜體內(nèi)部的大面積污染。E.明火使用原則：柜內(nèi)盡量不要使用明火!因為在明火使用過程中產(chǎn)生的細小顆粒雜質(zhì)將被帶入濾膜區(qū)域，這些高溫雜質(zhì)會損傷濾膜。無法避免一定需要使用的時候，宜使用低火苗的本生燈。 F、需定時檢測工作臺性能，并記錄檢測結(jié)果，根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整過濾器。 G、該設(shè)備應(yīng)有專人保管并記錄使用和檢修情況。 消毒知識點干熱滅菌法 干熱的殺菌作用是通過脫水干燥和大分子變性。一般細菌繁殖體，在干燥狀態(tài)下80100經(jīng)1小時可被殺死；芽孢則需160170，2小時才能殺滅。干熱滅菌機制如下：使菌體蛋白質(zhì)變性；電解質(zhì)濃縮引起中毒。干熱滅菌法包括： （

38、1）焚燒法：用火焚燒，是一種徹底的滅菌方法，僅適用于廢棄的污染物品和有傳染性的動物尸體等。 （2）燒灼法：微生物操作用器材可在火焰上燒灼滅菌，但在分子生物學實驗中已不主張使用。 （3）干烤法：需在干烤箱內(nèi)進行，通電后利用高熱空氣進行滅菌。一般加熱160170，維持2小時即可殺滅包括芽孢在內(nèi)的一切微生物。本法滅菌物品主要限于玻璃器皿、磁器或需干燥的注射器等。 （4）紅外線：產(chǎn)生熱效應(yīng)，但只能照到物體的表面，多用于醫(yī)療器械的滅菌。 消毒知識點濕熱滅菌法 濕熱滅菌法是最常用的滅菌法，效果較好。在同一溫度下濕熱殺菌效果優(yōu)于干熱，其原因有三：濕熱中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固。試驗表明，蛋白質(zhì)含水量增加

39、，凝固所需的溫度降低；濕熱比干熱的穿透力好，這主要是由于水或蒸汽傳導熱能的效率明顯高于空氣；蒸汽有潛熱存在。每一克水在100時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)可放出529卡的熱量。這種潛熱能迅速提高被滅菌物質(zhì)的溫度。 濕熱殺菌機制相對復雜，主要有以下幾點：使菌體蛋白質(zhì)變性和凝固；使細菌核酸降解；使細菌胞漿膜損傷。常用的濕熱殺菌法有： （1）煮沸法：煮沸1005分鐘可殺死細菌的繁殖體，但一般消毒以煮沸10分鐘為宜，殺死芽孢則需煮沸13小時。煮沸法主要用于一般外科器械、注射器、膠管和食具等的消毒。若水中加入l2碳酸氫鈉，可提高沸點105，既可增強殺菌能力，又可防止金屬器械生銹。 （2）流動蒸汽滅菌法：又稱常壓蒸汽

40、消毒法，是利用一個大氣壓下100的水蒸汽進行消毒，加熱1530分鐘可殺死細菌的繁殖體，但不保證殺死芽孢。 （3）間歇蒸汽滅菌法：是利用反復多次的流通蒸汽殺死細菌所有繁殖體和芽孢的一種滅菌法。本法適用于耐熱物品，也適用于不耐熱的含糖、牛奶等培養(yǎng)基。 （4）高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌法，滅菌的溫度取決于蒸汽的壓力。在一個大氣壓下，蒸汽的溫度是100。如果蒸汽被限制在密閉的容器里，隨著壓力的升高，蒸汽的溫度也相應(yīng)的升高。在103.4kPa(1.05kgcm2)蒸汽壓力下，溫度達到121.3，維持1520分鐘，可殺滅包括細菌芽胞在內(nèi)的所有的微生物。此法適用于高溫和不怕潮濕物品的

41、滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)器械、注射器、手術(shù)衣、敷料和橡皮手套等耐高溫、耐濕熱物品的消毒。 （5）巴氏消毒法：常用于牛奶和酒類的消毒。此法可殺死物品中的病原菌或一般雜菌，而不嚴重破壞物品的質(zhì)量。方法有兩種：一種是加熱61.162.830分鐘；另一種是71.7經(jīng)1530秒，現(xiàn)廣泛采用后法。 消毒知識點其他物理殺菌方法 (一)輻射殺菌法 1紫外線 日曬是一種有效的天然殺菌方法，其殺菌作用主要是靠日光中的紫外線。將病人的被褥、衣服、書報等放在日光下暴曬數(shù)小時，可達到消毒之目的。一般用于消毒的人工紫外線是由低壓水銀蒸汽燈、紫外線燈產(chǎn)生的。由于紫外線穿透力較弱，不能透過玻璃、紙張等物品，故只適用

42、于空氣和物品表面的消毒。紫外線對人體皮膚和眼睛角膜有一定的損傷作用，使用紫外線燈照射時應(yīng)注意防護。 紫外線的殺菌作用與其波長有關(guān)，通常波長為240280nm者具有殺菌作用。其中以260nm最強。 2電離射線 電離射線具有較高的能量和穿透力，可直接或間接破壞微生物的核酸、蛋白質(zhì)和酶系統(tǒng)，從而對其產(chǎn)生致死效應(yīng)。用于消毒滅菌的電離射線有X射線 (二)濾過除菌法 濾過除菌是用特殊的器具將液體或空氣中細菌除去的方法。所用器具是含有微細小孔的濾菌器，通常大于孔徑的細菌不能通過，借以獲得無菌液體或空氣。主要用于不耐高溫滅菌的血清、毒素、抗生素、藥液和空氣等的除菌，除菌濾器一般不能除去病毒、支原體和L型細菌。

43、 濾菌器的種類很多，目前常用的有蔡氏濾菌器、玻璃濾菌器、薄膜濾菌器。 (三)超聲波殺菌法 超聲波可以裂解多數(shù)的細菌，尤其是革蘭陰性菌更為敏感，但往往有殘存者。目前，超聲波主要用于粉碎細胞，以提取細胞組份或制備抗原等。超聲波裂解細菌的機制主要是它通過水時發(fā)生的空(腔)化作用，在液體中造成壓力改變。 (四)干燥與低溫抑菌法 有些細菌的繁殖體在空氣中干燥時會很快死亡，例如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、霍亂弧菌等，但有些細菌的抗干燥力較強，如溶血性鏈球菌在塵埃中存活可達25天，結(jié)核分枝桿菌在干燥的痰中可數(shù)月不死。芽胞的抵抗力更強，炭疽芽胞桿菌的芽胞耐干燥可達20多年。干燥法常用于保存食物，濃鹽或糖漬食品可

44、使細菌體內(nèi)水分散失，造成生理性的干燥，細菌的生命活動停止，防止食物變質(zhì)。 低溫可使細菌的新陳代謝減慢，常用做保存細菌菌種，當溫度回升至適宜范圍的時候，又能恢復生長繁殖。為避免解凍時對細菌的損傷，可在低溫狀態(tài)下真空抽去水分，此法稱為冷凍真空干燥法。消毒知識點化學消毒法 化學消毒法是利用化學藥物殺死或抑制病原微生物的方法。具有殺菌作用的化學藥品稱化學消毒劑；用于抑制微生物生長繁殖的化學藥品稱防腐劑?；瘜W消毒劑不僅對細菌有毒害作用，對人體組織細胞也有損傷作用。因此，只能外用或用于環(huán)境的消毒。 根據(jù)化學消毒劑的殺菌機制的不同，主要分為以下幾類： (1) 促進菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，例如酚類(高濃度)、醇

45、類、重金屬鹽類(高濃度)、酸堿類、醛類； (2) 干擾細菌的酶系統(tǒng)和代謝，例如某些氧化劑、重金屬鹽類(低濃度)與細菌的-SH基結(jié)合使有關(guān)酶失去活性； (3) 損傷細菌的細胞膜，例如酚類(低濃度)、表面活性劑、脂溶劑等，能降低細菌表面張力并增加其通透性，胞外液體內(nèi)滲，致使細菌破裂。 酚類：石炭酸、來蘇、洗比泰等酚類化合物，低濃度時破壞細菌細胞膜，使胞內(nèi)容物漏出；高濃度時是菌體蛋白質(zhì)凝固。 醇類：殺菌機制在于去除細菌胞膜中的脂類，并是菌體蛋白質(zhì)變性。乙醇最常用，濃度7075%時殺菌力最強，高濃度因能使菌體表面蛋白質(zhì)迅速凝固，殺菌力反而降低。 重金屬鹽類：高濃度時與帶陰性電荷的菌體蛋白質(zhì)結(jié)合，使之發(fā)

46、生變性或沉淀，也可以與細菌酶蛋白的-SH基結(jié)合，使其喪失酶活性。 氧化劑：常用的有過氧化氫、過氧乙酸、高錳酸鉀與鹵素等。殺菌機制依靠其氧化能力。過氧乙酸為強氧化劑，對細菌的繁殖體和芽胞、真菌、病毒等都具有殺滅作用，應(yīng)用廣泛，但易分解并具有刺激性和腐蝕性，不適用于金屬器具的消毒。用于消毒的鹵素有碘和氯兩類，碘多用于皮膚的消毒，氯多用于水的消毒。氯化合物有漂白粉、次氯酸鈣、次氯酸鈉等。 表面活性劑：常用于消毒的表面活性劑有新潔爾滅。 烷化劑：殺菌機制在于對細菌蛋白質(zhì)和核酸的烷化作用，殺菌譜廣，殺菌力強。常用的有甲醛、環(huán)氧乙烷和戊二醛等。缺點是有些對人體有毒性，并且有些烷化劑可能有致癌作用。 消毒知

47、識點影響消毒滅菌的效果因素 1 消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時間 消毒劑在一定濃度下，對細菌的作用時間越長，消毒效果越好。 2 微生物的種類與數(shù)量 同一消毒劑對不同微生物的殺菌效果不同，一般的消毒劑對結(jié)核分枝桿菌的作用要比其他細菌繁殖體作用差；70乙醇能殺死一般細菌繁殖體，但不能殺滅細菌的芽胞，必需根據(jù)消毒對象選擇合適的消毒劑。此外，微生物的數(shù)量越大，所需要的消毒的時間就越長。 3 溫度 溫度升高可以提高消毒效果。 4 酸堿度 消毒劑的殺菌作用受酸堿度的影響，例如戊二醛本省呈中性，其水溶液呈弱酸性，不具有殺滅芽胞的作用。 5 有機物 環(huán)境中有機物的存在可影響消毒的效果。 細菌檢驗基本技術(shù)：芽胞染色

48、、莢膜染色及鞭毛染色 1 芽胞染色 用著色力強的染色劑孔雀綠在加熱條件下染色，使染料不僅進入菌體也可以進入芽孢內(nèi)，進入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，而進入芽胞一經(jīng)著色則很難被水洗脫色。當用復染劑染色后，芽胞仍保留初染劑的顏色，而菌體和芽胞囊被染成復染劑的顏色，使芽胞和菌體更容易區(qū)分。 芽胞染色的操作步驟： 制成菌懸液孔雀綠染色分鐘將試管水浴加熱分鐘一用接種環(huán)取加熱染色菌液制成涂片干燥固定水洗脫色蕃紅花或稀釋石炭酸復紅復染分鐘水洗晾干油鏡觀察。 2 莢膜染色 由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色而莢膜不著色，從而使莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含

49、水量在以上，故染色時一般不加熱固定，以免莢膜皺縮變形。 在莢膜染色方法中，以負染色法和濕墨水法較為常用，其中濕墨水法較簡便，并且適用于各種有莢膜的細菌。 3 鞭毛染色 細菌的鞭毛極細，直徑一般為，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用鍍銀法染色。在顯微鏡下，主要觀察菌落結(jié)構(gòu)，表面特征和菌落邊緣的形態(tài)等。例如炭疽芽胞桿菌菌落邊緣呈現(xiàn)大量卷曲的纖絲狀紋理，稱為獅鬃樣菌落；鼠疫菌落表面呈現(xiàn)粗糙的顆粒狀突起，在血瓊脂平板上生長的菌落邊緣帶有

50、“花邊”；支原體的菌落呈現(xiàn)“荷包蛋”狀等。生活飲用水水質(zhì)微生物檢測樣品采集及處理知識點水樣的采集與保存 1、 水樣的采集 1.對容器的要求容器及瓶塞、瓶蓋應(yīng)能經(jīng)受滅菌的溫度，并且在這個溫度下不釋放或產(chǎn)生任何能抑制生物活動或?qū)е滤劳龌虼龠M生長的化學物質(zhì)。玻璃或聚丙烯塑料容器用自來水和洗滌劑洗滌，然后用自來水徹底沖洗。用硝酸溶液（1+1）浸泡，再用自來水，蒸餾水洗凈。 為了除去余氯，在滅菌前向容器里加入硫代硫酸鈉以還原余氯每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉（100gL）。 2容器滅菌熱力滅菌是最可靠而普遍應(yīng)用的方法。熱力滅菌分干熱和高壓蒸汽滅菌兩類。聚丙烯瓶只能用高壓蒸汽滅菌，玻璃瓶可用兩種方

51、法滅菌。干熱滅菌之后，玻璃容器是干燥的，便于保存和應(yīng)用；高壓蒸汽滅菌之后，應(yīng)自滅菌器中取出放在烤箱內(nèi)烤干，干熱滅菌所需溫度較高、時間較長。高壓蒸汽滅菌法要求12115分鐘，即可殺死芽胞。干熱滅菌法殺死芽胞需160180、維持2小時。 3為了除去余氯，在滅菌前向容器里加入硫代硫酸鈉以還原余氯每125ml水樣加0.1ml硫代硫酸鈉（100gL）。 4采集自來水時應(yīng)開啟水龍頭，適當放水數(shù)分鐘后再取樣。 二、水樣的保存方法 4保存，4小時內(nèi)進行檢驗。   醫(yī)療機構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識點醫(yī)療機構(gòu)污泥的采樣和樣品處理     

52、所采集的樣品應(yīng)具有代表性，制成約500g的表層和中層的平均混合樣品，置于無菌容器中帶回實驗室。     污水樣品采集后應(yīng)按檢驗要求盡快檢驗，如不能及時檢驗，應(yīng)將樣品放置冰箱內(nèi)保存，并應(yīng)在6小時內(nèi)檢驗。     （一）檢測糞大腸菌值時樣品的采集及處理     稱取采集的污泥樣品100g，溶解于100ml無菌生理鹽水中，充分攪拌均勻，用無菌吸管吸取此混懸液2ml，加入發(fā)酵管中培養(yǎng)；并將此混懸液依次稀釋后，吸取不同濃度的稀釋液按檢驗要求接種發(fā)酵管培養(yǎng)。

53、     （二）檢測沙門菌和志賀菌時樣品的采集和處理     稱取采集的污泥樣品30g，放入滅菌容器內(nèi)，加入300ml無菌生理鹽水，充分攪拌混勻，制成110混懸液，用無菌吸管吸取此混懸液100ml加入相應(yīng)增菌液中培養(yǎng)。     （三）檢測結(jié)核桿菌時樣品的采集和處理     稱取采集的污泥樣品10g，放入滅菌容器內(nèi)，加入100ml無菌水沖洗過濾（濾紙漏斗），再經(jīng)玻璃漏斗G2（孔徑1015pm）和G4

54、（孔徑34pm）抽濾，最后再經(jīng)濾膜（孔徑0.450.7靘）抽濾。取下濾膜，用4硫酸3ml，充分振蕩沖洗30分鐘。取上述酸性溶液各0.1ml，分別接種培養(yǎng)。     （四）檢測蛔蟲卵時樣品的采集和處理     采集回的樣品應(yīng)立即檢驗，如不能立即檢驗應(yīng)加入510ml 3或5甲醛或3鹽酸溶液，用平皿蓋住廣口瓶瓶口，然后放于冰箱內(nèi)，以防止微生物繁殖和蛔蟲卵的發(fā)育。  醫(yī)療機構(gòu)污水和污泥樣品的采集和處理知識點醫(yī)療機構(gòu)污水的采樣和樣品處理   &#

55、160; 所采集的樣品應(yīng)具有代表性，采集后應(yīng)立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗，如不能及時檢驗，應(yīng)將樣品放置冰箱內(nèi)保存，并應(yīng)在6小時內(nèi)檢驗。     （一）檢測總余氯指標時樣品的采集及處理     1所檢測樣品需在醫(yī)療機構(gòu)污水最終排放口處用沖洗干凈的玻璃容器采集。     2采樣后應(yīng)立即檢測，避免強光、振蕩及溫熱等因素的影響。     為避免污水中懸浮性固體對檢測結(jié)果的影響，可

56、用離心機離心分離，棄去懸浮物沉淀。     3被測樣品的溫度應(yīng)在1520。如低于此溫度，應(yīng)先將盛樣品的玻璃容器放人溫水中，使其溫度升至要求溫度后，再測定數(shù)值。     （二）檢測糞大腸菌群時樣品的采集及處理     1用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml，放入滅菌瓶內(nèi)（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5硫代硫酸鈉溶液5ml中和余氯）。     2采集好的水樣應(yīng)立即運往實驗室檢驗，一般不宜超過2小

57、時，否則應(yīng)在10下保存樣品，但需在6小時內(nèi)檢測。     （三）檢測沙門菌和志賀菌時樣品的采集和處理     1用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml，放入滅菌瓶內(nèi)（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5硫代硫酸鈉溶液5ml中和余氯）。     2采集好的水樣應(yīng)立即運往實驗室檢驗，一般不宜超過2小時，否則應(yīng)在10下保存樣品，但需在6小時內(nèi)檢測。     3取污水250ml，用無菌紗布或脫脂棉進行初濾，

58、然后用濾膜進行抽濾，將初濾后的紗布或脫脂棉和濾膜，放入相應(yīng)的增菌液中進行增菌培養(yǎng)。     （四）檢測結(jié)核桿菌時樣品的采集和處理     1用采水器或其他無菌容器采取污水樣1000ml。放入滅菌瓶內(nèi)（加氯消毒處理的污水應(yīng)加1.5硫代硫酸鈉溶液5ml中和余氯）。     2采集好的水樣應(yīng)立即運往實驗室檢驗，一般不宜超過2小時，否則應(yīng)在10下保存樣品，但需在6小時內(nèi)檢測。     3根據(jù)檢驗條件，可選用濾膜集菌法和離心集菌法進行集菌，然后進行接種和培養(yǎng)。     （1）濾膜集菌法：采用經(jīng)煮沸消毒的