數(shù)量性狀基因座(QTL)精細(xì)定位的研究進(jìn)展

1、數(shù)量性狀基因座(QTL精細(xì)定位的研究進(jìn)展來(lái)源:盧超的日志本文轉(zhuǎn)自博士論壇,希望與大家分享!生物界的許多性狀是以數(shù)量性狀為基礎(chǔ)的,該類(lèi)性狀的發(fā)生不是決定于一對(duì)等位基因,而是受到兩對(duì)或更多對(duì)等位基因的控制,每對(duì)等位基因彼此之間沒(méi)有顯性與隱性的區(qū)別,而是共顯性。這些等位基因?qū)υ撨z傳性狀形成的作用微小,所以也稱為微效基因(minor gen e,它們?cè)谌旧w上的位置稱為數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci, QTL。數(shù)量性狀就是由許多對(duì)微效基因的聯(lián)合效應(yīng)造成的一類(lèi)具有正態(tài)分布特性的性狀,具有這種性狀的個(gè)體在正態(tài)分布中的位置決定于它們所具有的微效基因的多少。數(shù)量性狀之所以復(fù)雜,

2、是因?yàn)檫@種性狀與基因型之間沒(méi)有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,并且環(huán)境因素對(duì)它有顯著的影響1。1961年,Thoday首次利用一對(duì)側(cè)翼標(biāo)記定位一個(gè)QTL2,隨后QTL的研究得到飛速發(fā)展?，F(xiàn)已證明,只要是控制連續(xù)分布性狀的數(shù)量性狀基因座,就能在實(shí)驗(yàn)群體或遠(yuǎn)交群體中定位3 。在整個(gè)QTL的研究中,可分為發(fā)現(xiàn)QTL,QTL的定位估計(jì)和精細(xì)定位4。Glazier認(rèn)為可分成四個(gè)步驟:連鎖和關(guān)聯(lián)分析,精細(xì)定位,序列分析和候選基因的功能檢測(cè)5。在模式生物小鼠的QTL研究,已描述的實(shí)驗(yàn)步驟更為詳細(xì)6:第一,把QTL定位到染色體的區(qū)段上。典型的QTL定位方法須對(duì)幾百個(gè)雜交后代進(jìn)行恰當(dāng)?shù)谋硇蜋z測(cè);利用覆蓋整個(gè)基因組的75-100

3、個(gè)遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因組掃描,遺傳標(biāo)記的平均跨度為15-20個(gè)厘摩(cM;準(zhǔn)確基因分型,然后對(duì)性狀和遺傳標(biāo)記之間進(jìn)行連鎖和關(guān)聯(lián)分析;計(jì)算QTL與某標(biāo)記位點(diǎn)靠近的可能性大小。這種方法即使經(jīng)過(guò)成百上千次的表型和基因型的分析,定位的QTL在染色體上還是一個(gè)較大的區(qū)間。第二,把一個(gè)QTL的作用與其它QTL的作用分開(kāi)。通常在同源系(congenic strain中進(jìn)行,這樣就把多基因遺傳的性狀轉(zhuǎn)化成單基因性狀進(jìn)行研究。目標(biāo)QTL與其它有作用的QT L分離后,仍須具有可測(cè)量的表型效應(yīng),否則達(dá)不到分離目的。該方法的局限性在于單個(gè)同類(lèi)系不能分解幾個(gè)連鎖在一起的有相同作用的QTL,特別是該性狀是由很多的基因控制的時(shí)

4、候。由于不知道單個(gè)QTL能否引起一個(gè)表型的可測(cè)量變化,使得進(jìn)一步的工作更加困難7, 8。第三,QTL的精細(xì)定位。在開(kāi)展分子水平的研究之前,盡可能把QTL所在的區(qū)間縮短至幾個(gè)厘摩,甚至更小的范圍內(nèi)。這就需要大量的染色體片段的重組和可靠的表型測(cè)定,解決方法是構(gòu)建一些特殊的實(shí)驗(yàn)群體,并對(duì)其中的特殊個(gè)體進(jìn)行后代測(cè)試(progeny testing。第四,鑒定和評(píng)估候選基因。模式生物基因組測(cè)序的完成,提供了該基因的全部序列信息。但是對(duì)于QTL已經(jīng)精細(xì)定位的遺傳距離還顯得太寬(1 cM 大約含有30個(gè)以上的基因。因此在對(duì)候選基因進(jìn)行功能檢測(cè)(functional test之前,必須清楚了解每個(gè)QTL對(duì)表型

5、的影響。第五,證實(shí)候選基因。一般用基因打靶或轉(zhuǎn)基因的方法。QTL是在漫長(zhǎng)的自然變異中形成的,研究QTL的最大挑戰(zhàn)是要在兩個(gè)親本之間精確區(qū)分高度連鎖在一起的多態(tài)性性狀。要證明一個(gè)QTL性狀是由某個(gè)等位基因引起,必須在主系(host strain中把該等位基因用其它基因替換并觀察效應(yīng),這在技術(shù)上很困難,而且主系在很多情況下不是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的近交系9 -12。以上幾個(gè)步驟在QTL在研究過(guò)程中不是截然分開(kāi)的。由于QTL研究能夠定位基因,因此研究基因間的相互作用和功能,篩選和操縱農(nóng)作物的重要經(jīng)濟(jì)性狀,了解進(jìn)化,為復(fù)雜遺傳疾病提供新的診斷和治療方法,在學(xué)術(shù)界引起了廣泛的研究興趣13。在過(guò)去的20年里,已在人類(lèi)

6、、模式生物、植物中發(fā)現(xiàn)和定位了許多影響復(fù)雜性狀的QTL。隨著高通量的基因表達(dá)譜分析、新的分子遺傳工具對(duì)基因組的操作、比較制圖和復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)軟件的開(kāi)發(fā),使得QTL的精細(xì)定位和位置克隆成為可能。本文將對(duì)QTL精細(xì)定位的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。(一QTL精細(xì)定位的基本策略與方法QTL的初步定位在染色體上是一個(gè)比較寬的區(qū)間,有必要對(duì)此進(jìn)行精細(xì)定位,盡可能地把關(guān)鍵區(qū)間縮小,但精細(xì)定位難度很大。利用一般群體進(jìn)行QTL定位時(shí),QTL的可信區(qū)間通常在10 cM以上14,很難確定檢測(cè)到的一個(gè)主效QTL到底是一個(gè)還是包含有多個(gè)微效QTL 15。因此,還須構(gòu)建特殊的實(shí)驗(yàn)群體來(lái)精細(xì)定位QTL。目前設(shè)計(jì)了多種方法進(jìn)行QTL的精

7、細(xì)定位,如高分辨率的雜交(high-resolution crosses,構(gòu)建同類(lèi)系(congenic strains,近等基因系(near-isogenic lines,NIL,后代測(cè)試(p rogeny testing,連鎖不平衡(linkage disequilibrium ,LD分析,家系研究(family-b ased studies,或是病例-對(duì)照研究(case-control studies等5。實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始的低分辨率連鎖分析主要用來(lái)發(fā)現(xiàn)QTL,以便進(jìn)行接下來(lái)的精細(xì)定位研究,與其相反的是,高分辨率研究的目標(biāo)是有效縮小侯選區(qū)間的范圍。綜合使用這些方法能把QTL的可信區(qū)間降到1cM 以

8、下16-19。研究QTL精細(xì)定位最好的群體是構(gòu)建目標(biāo)QTL的近等基因系(QTL-NIL。近等基因系的基本特征是整個(gè)染色體組的絕大部分區(qū)域完全相同,只在少數(shù)幾個(gè)甚至一個(gè)區(qū)段存在彼此差異。因此,它能使基因組中只存在一個(gè)或幾個(gè)QT L分離。這樣做可以消除其她背景干擾和消去主效QTL對(duì)微效QTL效應(yīng)的掩蓋作用,從遺傳上和統(tǒng)計(jì)上為QTL定位創(chuàng)造條件。盡管近等基因系構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)、工作量大,但近等基因系對(duì)QTL分解和精細(xì)定位的獨(dú)特優(yōu)越性使其成為分離和克隆QTL的理想群體。構(gòu)建近等基因系,首先需要對(duì)QTL初步定位,再結(jié)合回交和分子標(biāo)記輔助選擇,對(duì)QTL靶區(qū)間進(jìn)行正選擇,對(duì)背景進(jìn)行負(fù)選擇,從而快速構(gòu)建靶區(qū)間的近等

9、基因系。如果創(chuàng)建一套覆蓋全基因組的染色體片段的替代系,將對(duì)QTL精細(xì)定位提供非常便利的條件。目前在番茄中已建立起這樣的替代系20。DorweiIer等21利用近等基因系把控制玉米主穗差異的基因座TGA1,精確定位成孟德?tīng)柣?。Yamamoto等22用連續(xù)回交選育的方法獲得水稻抽穗期近等基因系,其后代的抽穗期分離呈現(xiàn)一對(duì)基因的孟德?tīng)栠z傳分離規(guī)律,6號(hào)染色體上的抽穗期主效QTL(Hd1定位在相距0.6 cM的R1679-P130之間,與C235共分離。Yano等23把一個(gè)12kb的基因組序列確定為該QTL的候選基因,并發(fā)現(xiàn)雙親的等位基因序列間存在多種差異,包括堿基替換、一段缺失和一段插入等。應(yīng)用N

10、ILs和亞NILs(sub-NILs,精細(xì)定位了3個(gè)番茄遲發(fā)枯萎抗性QTL24。理論研究表明,縮小QTL可信區(qū)間的瓶頸在于研究群體只能提供有限的減數(shù)分裂的信息25, 26。因此,有學(xué)者建議應(yīng)充分利用生物在長(zhǎng)期繁育過(guò)程中累積起來(lái)的標(biāo)記與QTL之間的重組信息。目前,常聯(lián)合采用連鎖與連鎖不平衡進(jìn)行QIL的精細(xì)定位27(二近交群體中QTL的精細(xì)定位能夠方便構(gòu)建近交群體的生物,如水稻28、玉米29、小麥30、果蠅31、酵母32等,使得一些數(shù)量性狀得到了精細(xì)定位。本文著重介紹近交小鼠的精細(xì)定位。近交小鼠是研究復(fù)雜性狀和人類(lèi)疾病的很好的模型。一個(gè)近交系是由經(jīng)過(guò)連續(xù)20代以上全同胞或親子交配培育而成的品系,可

11、以認(rèn)為在整個(gè)基因組上所有的遺傳位點(diǎn)都是純合的。只要品系間有差異,就可以利用品系間雜交2代、2代以上以及回交群體中性狀分離的個(gè)體進(jìn)行控制基因位點(diǎn)的確定。利用近交小鼠可構(gòu)建許多精細(xì)定位所需的群體。1、以高級(jí)互交系(Advanced intercross line, AIL進(jìn)行QTL的精細(xì)定位該策略是Darvasi在1995年提出的33。AIL是由兩個(gè)近交系隨機(jī)交配產(chǎn)生F1代,F1代個(gè)體再隨機(jī)互交產(chǎn)生F2代。以同樣的方式產(chǎn)生AIL F3、F4、F5,直到獲得實(shí)驗(yàn)所需的A IL為止。為了增加染色體間重組的概率,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁殖中應(yīng)避免同窩間的交配。AIL能進(jìn)行QTL精細(xì)定位的理論基礎(chǔ)是一個(gè)群體之間不斷

12、的互交,能減少連鎖不平衡,使得任何連鎖位點(diǎn)之間重組的幾率趨向于0.534。經(jīng)過(guò)多代交配以后,精細(xì)定位所需的重組事件就會(huì)在AIL個(gè)體中積累,達(dá)到實(shí)驗(yàn)檢出的水平。對(duì)AIL群體大小的要求是不少于100只。利用AIL尋找QTL時(shí),因能打破QTL與連鎖標(biāo)記位點(diǎn)之間的連鎖不平衡,所以可以把幾個(gè)連鎖的QTL與一個(gè)效應(yīng)較大的QTL區(qū)別開(kāi)。QTL定位的精度用可信區(qū)間來(lái)表示,與AIL定位精度有關(guān)的參數(shù)有染色體的長(zhǎng)度,QTL所在區(qū)間相對(duì)于染色體末端的距離,標(biāo)記之間的跨度,實(shí)驗(yàn)群體的大小,QTL效應(yīng)的大小等33,這和用F2代小鼠定位參數(shù)是一致的35。一些在F2代中提高定位準(zhǔn)確性的方法,如Zeng36提出的"

13、復(fù)合區(qū)間作圖法"(CIM,在AI L中也同樣適用。當(dāng)在一個(gè)區(qū)間檢測(cè)一個(gè)QTL時(shí),CIM方法可利用其它標(biāo)記作為協(xié)方差控制其它QTL,并且減少了殘余方差,這樣檢測(cè)就有所改進(jìn),而且AIL能把連鎖在一起的QTL 顯著分開(kāi)。F2代和回交(back cross,BC小鼠,也能進(jìn)行QTL的精細(xì)定位,但須繁育大量的群體。比如,一個(gè)效應(yīng)為25%的QTL,精細(xì)定位至5 cM,利用F2代需4500個(gè)個(gè)體,而用AIL (F10只需1500個(gè)個(gè)體33。若繁育個(gè)體和表型測(cè)定的成本低,或是一些簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)性狀,用F2進(jìn)行精細(xì)定位也不失為一種方法。若表型很難測(cè)定,或?qū)σ恍?fù)雜的行為進(jìn)行定位,采用AIL更好。兩個(gè)近交

14、系雜交的后代經(jīng)連續(xù)20代以上兄妹交配可形成重組近交系(Recombinant inbred line, RIL,此過(guò)程中染色體的重組概率也在不斷增加,一個(gè)RIL積累的重組事件與AIL (F4的相同。使用AIL定位QTL的效率,和使用多個(gè)RIL是一致的,花費(fèi)卻只是培育一個(gè)RIL的費(fèi)用。若某個(gè)性狀是由少量低遺傳度的QTL決定的話,那么使用RIL更有效,因?yàn)镽IL更能降低環(huán)境因素的影響33。運(yùn)用A/J×C57BL/6J(F6AIL,Iraqi等人成功精細(xì)定位了小鼠三個(gè)錐體蟲(chóng)抗性數(shù)量性狀基因座37,38。Wang等人在C57BL/6J×NZB/BlNJ (F11群體精細(xì)定位了濃縮高

15、密度脂蛋白(HDL膽固醇的4個(gè)QTL39,分別位于1、5和16號(hào)染色體上。肺腺癌易感基因1-3 40在(A/J×C57BL/6 F(11 AIL中也得到了精細(xì)定位。2、選擇性表型測(cè)定(Selective phenotyping雖然繁育了大量的F2與BC群體,但只有在原QTL所在區(qū)間發(fā)生染色體重組的個(gè)體才用作表型的測(cè)定。因?yàn)橐坏┠硞€(gè)QTL定位到某個(gè)區(qū)間內(nèi),那么只有在那個(gè)區(qū)間內(nèi)發(fā)生重組的個(gè)體對(duì)精細(xì)定位才有意義。任何次數(shù)的重組都會(huì)縮小QTL所在的區(qū)間,隨后在更小的區(qū)間內(nèi)尋找新的重組。實(shí)驗(yàn)時(shí),需要測(cè)定表型的動(dòng)物總量會(huì)減少,減少量為F2代個(gè)體的1/2r(1-r,BC個(gè)體的1/r(r 為所研究Q

16、TL內(nèi)發(fā)生重組的概率,但繁育的動(dòng)物總數(shù)與F2和BC的個(gè)體數(shù)相同,所以這種方法不常用。3、利用帶有特異片段的同源系(interval-specific congenic strains,ISCS進(jìn)行精細(xì)定位若要對(duì)某區(qū)間進(jìn)行精細(xì)定位,須使在該區(qū)段內(nèi)發(fā)生染色體重組的個(gè)體與親本反復(fù)回交,以減少親本其它QTL對(duì)表型的影響。然后,這些個(gè)體再互交,選擇具有重組單倍體的純合子確立一個(gè)ISCS。雜交的每一步都需要用DNA標(biāo)記來(lái)篩選實(shí)驗(yàn)所需的個(gè)體以減少繁育代數(shù)。利用ISCS,Ehringer等人精細(xì)定位了小鼠3個(gè)與酒精有關(guān)的QTL,稱為Znf142, Ptprn和Z nf13341。作者還認(rèn)為,對(duì)ISCS小鼠聯(lián)合

17、使用高通量的序列比較和QTL的精細(xì)遺傳圖譜,可以加快從QTL到基因克隆的過(guò)程。4、重組后代檢測(cè)(Recombinant progeny testing如果個(gè)體帶有我們感興趣的重組染色體片段,可以讓它們與親本雜交,把QTL所在的區(qū)間在個(gè)體中固定下來(lái)。為了把QTL所在的可信區(qū)間由ycM減小為xcM,就必須有y/x個(gè)重組個(gè)體,每個(gè)個(gè)體帶有一個(gè)寬約y/x的重組區(qū)間,所有個(gè)體覆蓋原ycM的范圍。聯(lián)合ISCS和重組后代檢測(cè),把小鼠對(duì)酒精和戊巴比妥的撤退依賴性的QTL精細(xì)定位至4號(hào)染色體小于1cM的區(qū)間內(nèi)42,而在小鼠的體重QTL研究中,把X染色體上的區(qū)間縮小至2cM以內(nèi)43。5、重組近交分離試驗(yàn)(Reco

18、mbinant inbred segregation test,RISTRIST是十分新穎的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),充分利用了重組近交系(RI的高分辨率圖譜,并成功運(yùn)用到QTL的定位中。為了把QTL區(qū)間由ycM減小為xcM,須選擇y/x個(gè)RI系,各系在ycM 內(nèi)均發(fā)生重組,所有RI系的重組區(qū)段能覆蓋y cM的區(qū)間。有時(shí),實(shí)驗(yàn)實(shí)際所需的RI系數(shù)目比理論的要少,因?yàn)橐粋€(gè)RI系在感興趣的區(qū)間發(fā)生不止一次的重組。為了產(chǎn)生RIST群體,需P1和P2兩個(gè)近交系,以P1,P2交配產(chǎn)生一個(gè)RI。選擇一個(gè)在感興趣區(qū)段發(fā)生重組的RI與P1、P2交配產(chǎn)生F1代,分別稱為F1.1、F1.2,隨后F1代互交,產(chǎn)生RIST-F2代,稱

19、為F2.1、F2.2。RIST-BC是由P2×F1.1,產(chǎn)生BC1,P2×F1.2產(chǎn)生B C2。對(duì)于加性效應(yīng),趨向采用RIST-F2作為研究群體,因?yàn)樵谶@種情況下,標(biāo)記位點(diǎn)上同源基因型會(huì)提供更多的信息,并且只對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)純合的個(gè)體進(jìn)行表型測(cè)定。而當(dāng)考慮顯性效應(yīng)時(shí), RIST-BC會(huì)更有效。6、HS(heterogeneous stock與整個(gè)動(dòng)物種群相比,近交系所產(chǎn)生群體的遺傳異質(zhì)性顯著減小,那些在野生群中分離的Q TL在近交群體中有可能不分離。為了解決這個(gè)難題,Mott44等人構(gòu)建了HS。這是由近交系C57BL, BALB/c, RIII, AKR, DBA/2, I, A

20、和C3H/2按8種方式交配,共形成40個(gè)交配對(duì),它們的子代再隨機(jī)互交,這樣雜交60代,確保產(chǎn)生的每一代沒(méi)有共同的祖父母。這樣HS個(gè)體中的每一條染色體都是祖系(founder strains很好的遺傳嵌合體,它們重組的平均距離是1/60 或1.7 cM。HS提供了在8個(gè)近交系中尋找任一分離QTL的可能性。通過(guò)H S,Mott驗(yàn)證了原發(fā)現(xiàn)的5個(gè)與恐懼有關(guān)的QTL。由于HS充分利用了多代交配積累下來(lái)的交叉重組,所以經(jīng)過(guò)有限數(shù)目的連鎖雜交以后,一個(gè)親本的單倍型能夠被縮小至很小的區(qū)段。該理論在小鼠QTL的精細(xì)定位中把可信區(qū)間縮小到1cM45,比F2代得到的分辨率要提高30倍33,46。HS研究也存在一些

21、弊端:遺傳異質(zhì)效應(yīng)對(duì)QTL定位的干擾作用;缺乏遺傳背景明確的品系進(jìn)行隨后的功能研究6;定位的敏感性太高,有可能把QTL標(biāo)錯(cuò)47。利用HS群體,Volkman等人成功定位了決定小鼠股骨大小與形狀的QTL48,Galsworthy 等定位了決定小鼠一般認(rèn)知能力的QTL49。在研究酒精誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)中,在D2Mit94 和D2Mit304之間,發(fā)現(xiàn)3個(gè)QTLs,它們的分辨率達(dá)到2 cM或更小50。7、以敲除(Knock out的方法作為同源系來(lái)研究QTL僅僅通過(guò)回交的方法是不能消除側(cè)翼基因?qū)λ芯縌TL的影響的。即使回交100代,也只能把QTL區(qū)間縮小至2cM51。2001年Bolivar52等利用

22、近交系129的基因敲除小鼠與C 57BL/6J(B6回交,產(chǎn)生了B6的遺傳背景基礎(chǔ)上帶有129小片段染色體的小鼠。Bolivar比較了帶有129小片段染色體的B6小鼠與該129片段被敲除的B6小鼠(B6.129-KO的表型差異,如果發(fā)現(xiàn)不同,就能把敲除片段的效應(yīng)從側(cè)翼基因的效應(yīng)中區(qū)別出來(lái)。Jackson實(shí)驗(yàn)室已成功繁育了大量的B6.129-KO系小鼠供實(shí)驗(yàn)用,所以這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用前景十分廣闊53。以敲除方法產(chǎn)生的同源系,雖然可靠,但仍不能減少對(duì)RI、F2或回交群體的需要。聯(lián)合使用一些同源系分析方法,可能省略QTL初始定位的步驟,但有一些缺陷,比如和某個(gè)位點(diǎn)具有同向作用的QTL可能不易被發(fā)現(xiàn),也會(huì)

23、降低上位效應(yīng)以及相互作用的其她位點(diǎn)的信息。用B6.129-KO同源系可以定位新的QTL或確定已經(jīng)存在的QTL,但不可能把定位的區(qū)間降到1-2 cM以下,因?yàn)橥聪祹в械钠伪旧砭陀?0-20cM。但用這種方法可以加快129×B6精細(xì)定位和表型相近的QTL的定位。8、基因組標(biāo)簽小鼠基因組標(biāo)簽小鼠(genome-tagged mice, GTM是Iakoubova54等描述的。雖然同源系能進(jìn)行QTL的精細(xì)定位,但培育同源系時(shí)須不斷與親本回交,然后在每一子代個(gè)體中篩選帶有供體染色體片段的小鼠,比較費(fèi)時(shí)。加快這一過(guò)程的方法是構(gòu)建一個(gè)同源系庫(kù),在其它遺傳背景基礎(chǔ)上構(gòu)建包含有某供體小鼠整個(gè)基因組

24、的同源系。通過(guò)標(biāo)記輔助(marker-assis ted技術(shù)構(gòu)建了兩套重疊同源系,每套同源系包含有超過(guò)60個(gè)的小鼠品系。C57BL/6J 作為背景系,而DBA/2J 或CAST/Ei 作為供體系,由于選作背景系和供體系的小鼠在遺傳和表型上差異大,所以用GTM可快速定位表型的遺傳基礎(chǔ)。在復(fù)雜行為中,如學(xué)習(xí)與記憶的QTL等已經(jīng)在GTM中定位至8.8cM的區(qū)間內(nèi)55。9、染色體替代系(chromosome substitution strains, CSSsCSS是通過(guò)不斷回交的方法,培育僅有一條染色體和其她近交小鼠不同的近交系56。用來(lái)實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)親本只是某條染色體的不同,其它染色體均相同9。Nad

25、eau報(bào)道構(gòu)件建了帶有A/J染色體片段的B6小鼠(B6.A,后來(lái)又陸續(xù)構(gòu)建了A.B6,B6.129,和129.B6等CSS 小鼠。第一個(gè)CSSs被成功用來(lái)研究睪丸母細(xì)胞瘤遺傳易感性的基因定位。因?yàn)镃SSs有一個(gè)基本相同的遺傳背景,所以和分離系相比,作者僅用少量的CSSs群體就得到了很強(qiáng)的連鎖證據(jù)10。一旦CSSs被成功構(gòu)建,不需要進(jìn)一步的基因分型和雜交,就可以明確QTL是否存在在某條染色體上,而且不受其它分離QTL的影響。CSSs還可以用來(lái)繁育同源系(co ngenic strain,比傳統(tǒng)的方法相比,可減少繁育的代數(shù)。用一個(gè)CSS與供體系(donor str ain交配來(lái)尋找剩余QTL,可以

26、消除固定QTL的混雜影響。若能獲得兩個(gè)親本足夠的CSS 嵌合體,則更容易區(qū)別和發(fā)現(xiàn)基因的相互作用。CSS也能進(jìn)行QTL的功能研究。10、誘導(dǎo)突變利用化學(xué)誘變劑,如亞硝基乙基脲(ethylnitrosourea,ENU,可有效的誘導(dǎo)影響表型的單基因發(fā)生突變。ENU誘導(dǎo)的特定基因高頻突變,通常的形式是A:T和G:C之間的顛換57,產(chǎn)生一系列具有表型效應(yīng)的突變?nèi)后w。以廣譜致突變劑,如EMS 和ICR199等處理胚胎干細(xì)胞,可以增強(qiáng)誘導(dǎo)效果58,59。誘導(dǎo)突變時(shí),影響復(fù)雜性狀的每個(gè)基因都可能是潛在的被誘變對(duì)象。相同表型測(cè)試法可篩選突變的小鼠,若該方法具有在同源系中發(fā)現(xiàn)一個(gè)QTL 的敏感性,那么也能在誘

27、導(dǎo)突變系中檢測(cè)影響該性狀的突變基因。誘變實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是要有一系列高效、可靠的表型測(cè)定來(lái)檢測(cè)大量的突變小鼠,并且要設(shè)計(jì)隨后的試驗(yàn)來(lái)確證該表型是被誘導(dǎo)的。誘導(dǎo)突變也有一些局限性:和QTL一樣,一些突變也不容易被發(fā)現(xiàn);由于遺傳背景的影響,在連鎖交配時(shí)一些突變也不易被發(fā)覺(jué)。由于誘導(dǎo)突變很容易鑒定表型變異的遺傳基礎(chǔ),發(fā)現(xiàn)單基因突變引起的性狀改變,在QTL研究中可以省略很多繁復(fù)的步驟,為尋找基因提供了一條簡(jiǎn)單的途徑。在小鼠中進(jìn)行精細(xì)定位,在大鼠中也同樣適用。如利用同源系大鼠對(duì)NOD大鼠1型糖尿病的易感基因進(jìn)行了定位60。在自發(fā)高血壓大鼠(SHR中,通過(guò)cDNA點(diǎn)陣、同源性制圖和放射雜交(radiatio

28、n hybrid ,RH,對(duì)胰島素抗性基因進(jìn)了精細(xì)定位61。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了同源系大鼠的數(shù)量基因座Mcs1內(nèi)三個(gè)Copenhagen基因?qū)θ橄侔┑木哂锌剐宰饔?2。(三遠(yuǎn)交群體QTL的精細(xì)定位在近交系中構(gòu)建暫時(shí)性分離群體、永久性分離群體和近等基因系群體進(jìn)行精細(xì)定位的方法,在實(shí)驗(yàn)生物中是可行的,但在人類(lèi)和大部分家畜中是不切實(shí)際的。在這類(lèi)群體中不僅可以進(jìn)行非參數(shù)的連鎖分析對(duì)復(fù)雜性狀進(jìn)行定位,而且還可充分利用群體在繁衍過(guò)程中積累的歷史重組事件,即連鎖不平衡和血緣一致性(identity-by-descent, IBD進(jìn)行定位63。連鎖分析適合家系資料的研究,屬于低分辨率的研究,精度在10cM以內(nèi)64。應(yīng)

29、用連鎖分析對(duì)復(fù)雜的疾病進(jìn)行研究時(shí),可能由于疾病的遲發(fā)、缺少足夠的家系以及診斷不嚴(yán)格等因素,會(huì)嚴(yán)重影響研究的準(zhǔn)確進(jìn)行。由群體遺傳學(xué)理論已知,在生物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中,許多因子,如選擇、遷移、基因突變和遺傳漂變等,均可導(dǎo)致不同位點(diǎn)間的等位基因連鎖不平衡的產(chǎn)生。當(dāng)群體隨機(jī)交配時(shí),位點(diǎn)間的連鎖程度會(huì)隨世代交替而衰退,其衰減速率與位點(diǎn)間的重組率呈固定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。群體中連鎖不平衡的長(zhǎng)期保持標(biāo)志著QTL與標(biāo)記位點(diǎn)存在緊密的連鎖關(guān)系。這樣,通過(guò)測(cè)定一個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與潛在的QTL之間的連鎖不平衡程度即可斷定QTL所在的位置。與連鎖分析相比,連鎖不平衡與關(guān)聯(lián)分析所研究的群體中,帶有相同的等位基因或單倍體的個(gè)體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)

30、,與典型的連鎖分析所用個(gè)體相比,有著更多的減數(shù)分裂。因此,關(guān)聯(lián)定位更精確。等位基因關(guān)聯(lián)研究是一種非參數(shù)性方法,它對(duì)連鎖分析所顯示出的興趣區(qū)域進(jìn)行候選基因位點(diǎn)和細(xì)致基因定位評(píng)價(jià)非常有用處,所以目前廣泛用來(lái)疾病基因的定位。對(duì)于常見(jiàn)的由高頻率、低風(fēng)險(xiǎn)等位基因引起的疾病,采用疾病位點(diǎn)等位基因的關(guān)聯(lián)分析比連鎖分析更為有效6 5。等位基因關(guān)聯(lián)是指疾病性狀的標(biāo)記等位基因發(fā)生率的顯著性改變(增加或降低,它代表與疾病性狀或表現(xiàn)型相關(guān)的等位基因在隨機(jī)發(fā)生中的偏差66。等位基因關(guān)聯(lián)研究起源于變異(多態(tài)性的直接生物學(xué)行為,或者源于相鄰可疑基因連鎖的失衡。連鎖失衡常發(fā)生于二對(duì)共同遺傳數(shù)代并在位置上非?？拷牡任换?一

31、般的規(guī)則是連鎖失衡越明顯,標(biāo)記基因距疾病基因位點(diǎn)越近,但這還要受標(biāo)記等位基因人群頻率和標(biāo)記位點(diǎn)突變率的影響。特殊表現(xiàn)型的優(yōu)勢(shì)選擇和隨機(jī)遺傳漂變,可使等位關(guān)聯(lián)分析復(fù)雜化。傳遞不平衡測(cè)試(transmission disequilibrium test, TDT被用來(lái)檢測(cè)遺傳性狀與標(biāo)記之間的連鎖與關(guān)聯(lián)關(guān)系。當(dāng)初TDT用來(lái)分析質(zhì)量或數(shù)量性狀時(shí),需雜合親本的非相關(guān)后代作為研究群體,現(xiàn)已擴(kuò)大了其使用范圍67,廣泛用在等位基因關(guān)聯(lián)研究中。有學(xué)者還專門(mén)研究了TDT在先天脊柱側(cè)凸和等位基因aggrecan關(guān)聯(lián)分析中的效率問(wèn)題68。利用連鎖不平衡理論,人類(lèi)遺傳學(xué)家已能把影響人類(lèi)疾病的質(zhì)量基因定位在小至1cM區(qū)域

32、內(nèi),有些基因已被克隆出來(lái)。Luo 69-71等人進(jìn)一步發(fā)展統(tǒng)計(jì)分析方法檢測(cè)及估算分子標(biāo)記與QTL之間的連鎖不平衡系數(shù),從而提出了人類(lèi)復(fù)雜遺傳疾病高解析度基因定位的理論策略。以此為基礎(chǔ),胡中立等進(jìn)一步探討了供試群體在雙親基因頻率存在差異時(shí)檢測(cè)QTL 和檢測(cè)QTL互作的方法,并給出了有關(guān)的理論結(jié)果72。有人發(fā)現(xiàn)連鎖/連鎖不平衡綜合分析,效果比單純連鎖分析或LD分析更好, 尤其是在影響性狀的基因比較多,QTL內(nèi)有大量的突變和標(biāo)記密度較低的時(shí)候更為適用73。Bayesian法就是聯(lián)合運(yùn)用了連鎖/連鎖不平衡綜合分析,由于充分考慮了每個(gè)標(biāo)記和每個(gè)子代的信息,所以不管有無(wú)LD信息,Bayesian法均可以精

33、確估計(jì)加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)74。由于第三代遺傳標(biāo)記SNPs數(shù)量多、分布廣泛、相對(duì)穩(wěn)定且易于篩查和基因分型,在群體遺傳學(xué)得到廣泛應(yīng)用,豐富了對(duì)群體遺傳學(xué)的認(rèn)識(shí),能更好了解基因型-表型的關(guān)系,極大提高了數(shù)量性狀的精細(xì)定位能力。對(duì)小部分染色體區(qū)域的研究表明:不同遺傳背景的SNPs可以引起相關(guān)群體不同標(biāo)記的連鎖不平衡的明顯變化75。已經(jīng)證實(shí):LD不僅與物理圖距有關(guān),而且與標(biāo)記所包含的信息有關(guān)。使用雙等位SNP標(biāo)記,可以把LD固定在0.1cM左右76。為了更有效地應(yīng)用連鎖不平衡進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究,必須仔細(xì)選擇具有相同病因起源的人群作為研究對(duì)象。總之,進(jìn)行SNPs 關(guān)聯(lián)分析應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面:病例和對(duì)照人群起源相

34、同,各項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。連鎖和關(guān)聯(lián)分析結(jié)合分析。采用一個(gè)或很少的標(biāo)記得到的陰性相關(guān)結(jié)果并不能排除其周?chē)蛄袑?duì)疾病的風(fēng)險(xiǎn)性。與疾病相關(guān)的陽(yáng)性標(biāo)記未必能確定其周?chē)闹虏⌒蛄?。?yīng)用致病等位基因與其周?chē)鶶NPs的連鎖不平衡性可提高關(guān)聯(lián)分析的效果。理論上,如果某一SNP與其附近的致病等位基因呈現(xiàn)較強(qiáng)的連鎖不平衡性,那么二者應(yīng)該與疾病表現(xiàn)出相似的關(guān)聯(lián)性?？蓱?yīng)用一系列隨機(jī)SNPs掃描其周?chē)腄NA序列以發(fā)現(xiàn)指示起病效應(yīng)的關(guān)聯(lián)信號(hào)。由于基于連鎖不平衡進(jìn)行的關(guān)聯(lián)分析采用的是一組隨機(jī)的多態(tài)性標(biāo)記,并依賴于致病位點(diǎn)本身及其鄰近的標(biāo)記具有足夠的連鎖不平衡性,所以這種方法在隔離人群中非常有效。因?yàn)楦綦x人群可能起

35、源于同一祖先,群體的建立時(shí)問(wèn)和群體的大小都是確定的,隔離可以排除混雜群體因素。群體的建立時(shí)間可以提供與疾病相關(guān)基因突變形成的界限,而小群體也增加了疾病是由某一個(gè)體產(chǎn)生的可能性,從而增強(qiáng)了疾病與群體中一個(gè)特異單倍體的關(guān)聯(lián)。但對(duì)于其她群體來(lái)說(shuō),由于連鎖不平衡的不可預(yù)測(cè)性,基于連鎖不平衡進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究則比較困難77,78,這時(shí)可使用周?chē)蚪M中的SNPs進(jìn)行連鎖不平衡關(guān)聯(lián)研究79。對(duì)具有純合子型致病基因和固有連鎖不平衡的疾病人群進(jìn)行嚴(yán)格選擇,同時(shí)還應(yīng)考慮到單倍體之間的關(guān)系。有人對(duì)SNPs采用多點(diǎn)連鎖不平衡定位(multipoint linkage-disequilibrium mapping,不但可以

36、縮小區(qū)間,還可以鑒定變異的異質(zhì)性,選用SNPs的總量下降38%,而可信區(qū)間的范圍縮小20%80。在一些遲發(fā)疾病的關(guān)聯(lián)分析中,一些父母的基因型可能丟失。若沒(méi)有父母的基因型,家系分析時(shí)可比較受累個(gè)體與不受累同胞對(duì)之間等位基因頻率,或利用同胞來(lái)推測(cè)父母的基因型。統(tǒng)計(jì)軟件TRANSMIT就是利用了后一種方法。通過(guò)對(duì)血源一致性參數(shù)的估計(jì),對(duì)父母?jìng)鬟f和受累同胞之間的相關(guān)性進(jìn)行調(diào)整。模擬數(shù)據(jù)表明,這種方法的效率比子代的不平衡測(cè)試和家系關(guān)聯(lián)分析的效率高,有人還用此方法對(duì)家族性Parkinson病的侯選基因進(jìn)行了驗(yàn)證81。聯(lián)合運(yùn)用上述理論與方法,精細(xì)定位了控制牛奶成分的QTL。通過(guò)孫女設(shè)計(jì)(granddaugh

37、t er design,在含有1158個(gè)個(gè)體的牛群中,對(duì)BT6q11-16區(qū)間內(nèi)9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和3個(gè)SNPs標(biāo)記進(jìn)行高密度遺傳圖譜的連鎖和關(guān)聯(lián)分析,精細(xì)定位了控制牛奶成分的QTL82-8 4,在這區(qū)間里的DGAT1基因可能是侯選基因85。人類(lèi)的很多遺傳病也得到了精細(xì)定位。在一些人群中證實(shí)了HLA-DQA與1型糖尿病關(guān)聯(lián)關(guān)系86。通過(guò)對(duì)全基因組的掃描,在2號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與2型糖尿病強(qiáng)烈連鎖的區(qū)間87。在尋找與其相互連鎖的區(qū)間時(shí),把該區(qū)間縮小至7cM。這個(gè)區(qū)間跨度只有1700kbp。在該區(qū)間運(yùn)用多個(gè)SNPs的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)2型糖尿病可能與calpain-10 (CAPN10有關(guān)8 8。中國(guó)北

38、方漢族人群2型糖尿病候選易感基因也取得了很大的進(jìn)步。杜瑋南等通過(guò)增加微衛(wèi)星位點(diǎn)密度,擴(kuò)大樣本量,運(yùn)用GeneScan和G enotyper程序獲得位點(diǎn)信息,最后經(jīng)參數(shù)和非參數(shù)連鎖分析,對(duì)1號(hào)染色體上的中國(guó)北方漢族人群2型糖尿病易感基因進(jìn)行了驗(yàn)證和精細(xì)定位89。并對(duì)其中的易感基因,蛋白激酶C亞型(PRKCZ內(nèi)的單核昔酸多態(tài)性進(jìn)行群體相關(guān)分析及連鎖不平衡分析,表明PRKC Z基因內(nèi)由5個(gè)SNP位點(diǎn)組成的單體型可能和中國(guó)北方漢族人2型糖尿病相關(guān),進(jìn)一步從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度證實(shí)了PRKC Z基因?yàn)樵撊巳杭膊∫赘谢?0。血漿中淀粉樣蛋白(Abet92的水平,可以作為遲發(fā)阿爾采默病(LOAD的一個(gè)數(shù)量表型。有學(xué)

39、者先是在10號(hào)染色體上80cM處,發(fā)現(xiàn)了顯著連鎖關(guān)系,受累同胞對(duì)的研究也證實(shí)了這一結(jié)果。接下去的SNP連鎖不平衡分析,表明VR22與LOAD有相關(guān)性91。(四候選基因法進(jìn)行QTL的精細(xì)定位候選基因法也是精細(xì)定位QTL的一種有效方法。根據(jù)已知的生理、生化知識(shí)選擇具有某種功能的基因(候選基因,通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些基因及其分子標(biāo)記對(duì)特定數(shù)量性狀的效應(yīng),然后篩選出對(duì)數(shù)量性狀有影響的基因或標(biāo)記,并估計(jì)出它們對(duì)數(shù)量性狀的效應(yīng)值。目前設(shè)計(jì)了很多侯選基因的關(guān)聯(lián)分析法92。最簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)是流行病學(xué)的病例-對(duì)照研究,比較病例與對(duì)照組中等位基因的頻率。疾病與可測(cè)危險(xiǎn)因素的因果關(guān)系是其中的混雜因素。有兩種方法可以

40、解決混雜因素的干擾:配對(duì)病例-對(duì)照研究,把對(duì)照個(gè)體與病例相配對(duì),以消除潛在混雜因素如性別、年齡的影響,每對(duì)配對(duì)分別檢查危險(xiǎn)因素,觀察侯選基因在病例組中出現(xiàn)的頻率是否高于對(duì)照組。用親屬作為病例的對(duì)照。第一個(gè)設(shè)計(jì)的是非受累同胞作為對(duì)照。后來(lái)又設(shè)計(jì)了包括雙親的對(duì)照93,94。用候選基因法已成功地定位了一些基因,如豬的肥胖基因(Obesity、肌漿蛋白基因(Myogenin、雌激素受體基因(ESR、大腸桿菌k 88受體基因等95。雖然QTL的精細(xì)定位得到了快速的發(fā)展,但真正位置克隆的基因還不多。目前報(bào)道的還只有番茄果實(shí)重的主基因96,人類(lèi)對(duì)苯硫脲嘗味敏感基因等97。但是隨著人類(lèi)、小鼠等模式生物、水稻、

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