人群瘢痕疙瘩家系易感基因定位

1、人群瘢痕疙瘩家系易感基因定位    作者：陳陽，高建華，劉曉軍，嚴欣，宋玫 【關鍵詞】  瘢痕疙瘩家系；連鎖分析；微衛(wèi)星標記；易感基因；異質性Study on location for keloid susceptible locus in Chinese pedigrees【Abstract】 AIM: To locate keloid susceptible locus in Chinese pedigrees. METHODS: Peripheral venous blood samples from 51 members in 2 la

2、rge keloid pedigrees were collected for extracting genomic DNA. Six markers on chromosome 2q23 were selected as microsatellite markers according to recent foreign literatures on the similar study. Subsequently, these markers were amplified by PCR, and all PCR products were genotyped and the linkage

3、analyses were performed. RESULTS: Most of the twopoint LOD scores for these markers at =0 were less than -2, which excluded the linkage. CONCLUSION: The keloid susceptible locus in Chinese pedigrees were not on chromosome 2q23.【Keywords】 keloid pedigree; linkage analysis; microsatellite marker; susc

4、eptibility genes; heterogeneity【摘要】 目的： 定位中國人群瘢痕疙瘩家系的易感基因. 方法： 選擇2個中國人群瘢痕疙瘩大家系，從中選出51名成員，采集其外周靜脈血樣，提取基因組DNA；參照國外最近相似研究的文獻報道，采集其外周靜脈血樣，提取基因組DNA；參照國外最近相似研究的文獻報道，在染色體2q23上選取6個微衛(wèi)星標記，經PCR擴增，產物片斷基因分型，再進行連鎖分析. 結果： 在重組率=0時，這些微衛(wèi)星標記的兩點LOD值絕大部分-2，排除連鎖關系存在. 結論： 中國人群瘢痕疙瘩家系的易感基因位點不在染色體2q23上.【關鍵詞】 瘢痕疙瘩家系；連鎖分析；微衛(wèi)星標

5、記；易感基因；異質性【中圖號】 R596.20引言瘢痕疙瘩(keloid)是人體皮膚損傷后的一種病理性瘢痕愈合，其病因及發(fā)病機制目前尚不清楚. 流行病學調查表明，瘢痕疙瘩大多散發(fā)發(fā)病，但具有一定的家族遺傳傾向，且存在顯著的種族差異性1-2. Cosman等3證明其家族性發(fā)病率約為3，深膚色人種好發(fā). 國內外的研究一致認為，瘢痕疙瘩的遺傳模式為常染色體顯性遺傳,伴外顯不完全，其臨床表型存在個體差異4-5. 最近，Marneros等6的研究首次發(fā)現了1個日本家系和1個非洲裔美國人家系瘢痕疙瘩易感基因位點分別與染色體2q23和7p11連鎖的遺傳學證據，對進一步尋找瘢痕疙瘩發(fā)病的相關基因具有指導意義.

6、 但是，有關中國人群瘢痕疙瘩易感基因的定位至今仍未見報道，由于中國漢族人種與日本人種同屬蒙古人種，而非洲裔美國人屬尼格羅人種，為此，我們收集了來自我國不同地區(qū)的1個5代發(fā)病和1個4代發(fā)病的中國漢族人群瘢痕疙瘩大家系，從中分別選取32位和19位具有較高遺傳病研究意義的成員作為研究對象，在上述研究發(fā)現的基礎上，在染色體2q23及其周圍選擇已知的兩點LOD值1的6個微衛(wèi)星作為遺傳標記，通過連鎖分析以驗證中國人群瘢痕疙瘩家系易感基因位點是否也在染色體2q23上.1對象和方法1.1對象1個5代發(fā)病的NM（內蒙）家系和1個4代發(fā)病的LN（遼寧）家系（圖1，2）. 遵照赫爾辛基宣言的準則采集血樣和病理組織標

7、本. 指定2名對瘢痕疙瘩診斷和治療有相當臨床經驗的整形外科醫(yī)師，根據瘢痕疙瘩診斷標準7（即瘢痕超過原有損傷范圍并向周圍正常皮膚侵犯，或瘢痕病程超過1年仍無自發(fā)消退征象，或術后瘢痕復發(fā)者）對所有研究對象進行全面的體格檢查、詳細的病史詢問和準確的臨床診斷，并對部分患者的瘢痕疙瘩組織取活檢行組織病理學檢查以確診. 我們從NM和LN家系中分別選出32位和19位成員作為研究對象（即系譜圖中標號者），采集他們的外周靜脈血樣.圖1瘢痕疙瘩家系系譜（略）圖2LN瘢痕疙瘩家系系譜（略）1.2方法抽取這51名家系成員的外周靜脈血各2 mL(EDTA抗凝)，經SDS裂解，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀基因組DN

8、A后，用ddH2O溶解，放置-20保存以備后用. 根據參考文獻6在染色體2q23及其周圍共約33.4 Mbp區(qū)域內選取已知的6個兩點LOD值1的微衛(wèi)星標記D2S1328（LODZMAX=2.01）， D2S349 （LODZMAX=2.84）， D2S1399 （LODZMAX=2.86）， D2S356（LODZMAX=2.84）， D2S2275 （LODZMAX=2.29）和D2S1353 （LODZMAX=0.89），通過UCSC Genenome()和Ensembl（/Homo_sapiens/mar

9、kerview）遺傳學數據庫，查找出這些微衛(wèi)星標記的上下游引物序列(    表1)，再合成相應的引物. 根據上述各自的上、下游引物序列設計合成相應的PCR引物，PCR擴增在PE9700型PCR反應儀中進行. PCR反應體系：基因組DNA 50100 ng，上、下游引物各10 mol/L（1 L），GeneAmp dNTP 1 L，Takaka Ex Taq DNA聚合酶33.34 nkat，10×Ex Tag Buffer（Mg2+ Plus） 1 L，加雙蒸去離子水至總體積10 L. PCR反應條件：95預變性5 min后,94變性30 s，

10、5557退火30 s，72延伸30 s，38次循環(huán)后,72延伸10 min. 熒光標記引物由上?；瞪锛夹g有限公司提供，PCR擴增試劑由Applied Biosystems公司提供. 將HiDi Formamide 1 mL和GeneScan500 LIZ Size Standard 50 L混合后，取9.5 L同PCR產物（20倍稀釋后） 0.5 L混合，95變性5 min后迅速冰浴冷卻5 min，再在ABI PrismTM 310 Genetic Analyzer上用PE公司的POP4膠，15 kV，60下，電泳28 min. 電泳數據經Genescan軟件（V3.11）, Genoty

11、per（V.3.7）處理后得到檢測片段大小和基因型. 以上儀器、試劑及軟件由美國Perkin Elmer公司提供. 基因分型數據經家系和人工校對后，用連鎖分析軟件Linkage（V.5.11）的Mlink程序計算每個標記位點的兩點LOD（log of the odds，Lod）值，其中重組率=00.4；遺傳模式為常染色體顯性遺傳伴不完全顯性，外顯率90%，擬表型1，群體疾病基因型頻率1/1000 5-6；根據算出的兩點LOD值判斷連鎖關系. LOD值表示在不同重組率（）的條件下，兩位點連鎖的可能性與不連鎖的可能性之間概率比值的對數. LOD值1支持連鎖，LOD值3肯定連鎖，LOD值-2否定連鎖

12、.表1微衛(wèi)星標記名稱、位置、引物序列及產物大?。裕?結果連鎖分析結果表明，在重組率=0時，兩點LOD值除NM家系中D2S1399的為0.71和LN家系D2S349的為-0.12外，其余微衛(wèi)星標記的均-2（表2，3）.3討論我們所選擇的瘢痕疙瘩家系中共有3個肯定攜帶者，可以解釋為外顯不完全，也可以認為是不規(guī)則顯性遺傳，即雜合子的顯性由于某種原因而不表現出相應的性狀，但他們卻可以生出具有該性狀的后代，因此在系譜中可以出現隔代遺傳現象，目前認為機體的內外環(huán)境對基因表達所產生的影響和不同個體所具有的不同遺傳背景可能是引起不規(guī)則顯性的重要因素8；而LN家系性狀遺傳表現為完全外顯，遵循典型的常染色體顯性

13、遺傳規(guī)律. 家系中出現雙親未發(fā)病而子女發(fā)病的現象，提示相關基因可能出現了新的變異. 經文獻檢索，本研究所選擇的這2個家系是至今所報道的中國人群瘢痕疙瘩家系中最大和最多的，其中NM家系5代63人，健在成員4代56人，發(fā)病5代14人，健在患者3代11人；LN家系4代49人，健在成員4代48人，發(fā)病4代10人，健在患者3代9人. 它們都能較好地滿足遺傳病研究對家系的要求，對中國人群瘢痕疙瘩致病基因等相關研究具有較好的代表性. Marneros等6發(fā)現，瘢痕疙瘩日本家系與染色體2q23連鎖，并認為位于染色體2q23的153cM(152 Mbp)處的壞死因子抑制蛋白6（TNFAIP6）基因是瘢痕疙瘩的一

14、個候選基因，但是對這個候選基因的外顯子、內含子與外顯子的拼接點及啟動子序列進行測序，并未發(fā)現突變存在. 因此，認為在該候選基因位點附近可能存在其它基因突變，才導致瘢痕疙瘩的形成. 另外，他們還報道了對一個有10人發(fā)病的非洲裔美國人中等大小的瘢痕疙瘩家系進行同樣的研究，卻沒發(fā)現與2q23和7p11存在連鎖關系，說明瘢痕疙瘩易感基因位點存在異質性. Marneros等6的研究首次發(fā)現了存在瘢痕疙瘩易感基因位點的遺傳學證據，對進一步尋找瘢痕疙瘩的致病基因具有重要的指導意義.由于瘢痕疙瘩的發(fā)病存在顯著的種族差異性，為了驗證中國人群瘢痕疙瘩家系易感基因位點是否也分布在上述染色體區(qū)域，為此，我們選取了這2

15、個中國人群瘢痕疙瘩大家系，以同樣的方法進行研究，其連鎖分析結果顯示可以排除該瘢痕疙瘩家系與2q23的連鎖關系，再次證明了瘢痕疙瘩易感基因位點存在異質性，提示瘢痕疙瘩易感基因可能存在種族特異性，即不同種族瘢痕疙瘩的形成可能由不同的致病基因調控，這與流行病學調查發(fā)現瘢痕疙瘩好發(fā)于有色人種尤其多發(fā)于深膚色人種的現象相一致. 最近，張剛等9采用比較基因組雜交方法檢測了6例瘢痕疙瘩患者的染色體后發(fā)現染色體1p,16p,20q和22p存在部分缺失，推測這種缺失導致抑制性基因的丟失，造成瘢痕疙瘩的發(fā)生和發(fā)展，從而認為瘢痕疙瘩的發(fā)病可能與染色體的結構畸變有關. 由此可見，瘢痕疙瘩是一種復雜的遺傳性疾病，要準確

16、定位和明確瘢痕疙瘩的致病基因，需要收集數量更多質量更高種族來源更廣的家系，并應用更先進的研究方法，如全基因組掃描、選擇多態(tài)性更高的SNP作為遺傳標記和對候選基因進行測序檢測基因突變等.表2NM家系微衛(wèi)星標記不同值的LOD值（略）表3LN家系微衛(wèi)星標記不同值的LOD值（略）【參考文獻】1 Alhady SM, Sivanantharajah K. Keloids in various races: A review of 175 cases J. Plast Reconstr Surg, 1969，44(7):564-570.2 Dustan HP. Does keloid pathogenes

17、is hold the key to understanding black/white difference    s in hypertension severity ?J. Hypertension, 1995，26(6):858-862.3 Cosman B, Crikelair GF, Ju DM, et al. The surgical treatment of keloidsJ. Plast Reconst Surg, 1961，27(6):335-338.4 Marneros AG, Norris JE, Olsen BR, et al. Clinical genetics of familial keloidsJ. Arch Dermatol, 2001，137(11):1429-1434.5 陳陽, 高建華，劉曉軍, 等. 瘢痕疙瘩中國家系的發(fā)病特點J. 中國美容醫(yī)學, 2006，15(1):6-10.6 Marneros AG, Norris JEC, Watanabe S, et al. Genome scans provide evidence for keloid suscepti