血液透析對(duì)白細(xì)胞粘附分子表達(dá)調(diào)節(jié)的影響

1、    血液透析對(duì)白細(xì)胞粘附分子表達(dá)調(diào)節(jié)的影響        【摘要】目的探討血透中粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)的變化規(guī)律及其對(duì)長(zhǎng)期透析患者免疫能力下降的可能作用。方法采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)血透患者粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面CD11b、CD45、CD54和L-selectin在透析中的表達(dá)水平，并觀察了不同的透析膜對(duì)其變化的影響；同時(shí)測(cè)定外周血中上述兩種細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果透析開(kāi)始后，細(xì)胞表面CD11b的表達(dá)迅速上升，而L-selectin則顯著下降，同時(shí)伴隨外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少

2、；銅仿膜組的變化顯著大于聚砜膜組。CD45的變化與CD11b的變化相似；二組患者細(xì)胞表面CD54在整個(gè)透析過(guò)程中基本無(wú)變化。結(jié)論白細(xì)胞表面粘附分子在血透中有規(guī)律的變化，導(dǎo)致了外周血白細(xì)胞減少，同時(shí)可能損害了白細(xì)胞的正常粘附能力，降低了機(jī)體的免疫力；而這些變化與使用的透析膜的生物不相容性有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】血液透析透析膜粘附分子白細(xì)胞生物相容性 The effects on the expression of leukocyte adhesion molecules during hemodialysisQIAN Jiaqi*，XU Xiaoqi,SHI Xuegeng，et al.*Renal D

3、ivision,Renji Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200001【Abstract】ObjectiveTo investigate the trends of leukocyte adhesion molecules expression by hemodialysis therapy,and the relationship between these changes with the impaired immunity in long-term hemodialysis patients.MethodsThe

4、 expressions of CD11b,CD45,CD54 and L-selectin on granulocytes and monocytes during dialysis with different dialyzer membranes were assessed by flow cytometry and the cells numbers were counted concomitantly.ResultsShortly after hemodialysis the expression of CD11b increased rapidly,while that of L-

5、sclectin decreased and also did the cells numbers.The magnitudes of these changes on CU were larger than those on PS.The overexpression of CD45 was similar to that of CD11b,while there was no significant change in the expression of CD54 during dialysis on either of membrane group.ConclusionThe regul

6、ar changes in the expression of adhesion molecules on leukcoytes not only lead to the leukopenia occuring in a dialysis session,but may also disturb the normal adhesion immune function of leukocytes in dialysis patients.All of these changes are associated with the dialyzer membrane'sbiocompatibi

7、lity.【Key wrods】HemodialysisDialyzer membraneAdhesion moleculeLeukocyteBiocompatibility細(xì)胞粘附分子是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類來(lái)自不同基因的配體/受體分子，它們介導(dǎo)了細(xì)胞信息傳遞的關(guān)鍵步驟1。與白細(xì)胞有關(guān)的粘附分子在白細(xì)胞趨化、吞噬、脫顆粒、釋放溶酶體、產(chǎn)生超氧離子等過(guò)程中有重要的生物學(xué)意義。白細(xì)胞共同抗原(CD45)為所有白細(xì)胞表面廣泛表達(dá)的一種具酪氨酸磷酸酶活性的糖蛋白復(fù)合物，這是T細(xì)胞通過(guò)T細(xì)胞抗原受體傳遞信號(hào)的前提物質(zhì)2。已知慢性腎衰血透患者可產(chǎn)生各種急、慢性并發(fā)癥，如感染、肺部病變、免疫力低下、殘腎功能丟失

8、加速、淀粉樣變等，其中感染是引起患者住院和死亡的重要原因。據(jù)報(bào)道約36%的透析患者死亡原因與感染有關(guān)3。這除與尿毒癥患者本身免疫力低下有關(guān)外，透析本身對(duì)機(jī)體的影響可能也起了很重要的作用。透析中血液與透析材料接觸后，產(chǎn)生一系列類炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了白細(xì)胞各種功能的改變。因此，我們通過(guò)觀察在使用不同透析膜透析過(guò)程中，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面細(xì)胞粘附分子(CD11b，CD54，L-selectin)和白細(xì)胞共同抗原(CD45)變化的規(guī)律，探討它們對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和機(jī)體免疫功能的可能影響。對(duì)象與方法一、研究對(duì)象選擇20例慢性腎衰規(guī)律性血透患者(男12例，女8例)，平均年齡(48.7±9.84)歲(333

9、6歲)，每周平均透析2.1次(1.53次/周)，每次5小時(shí)，均為碳酸氫鹽透析。平均透析時(shí)間為(18.31±21.68)月(2.3666.63月)。慢性腎衰的原發(fā)病為慢性腎小球腎炎14例，高血壓腎硬化2例，多囊腎2例，慢性腎盂腎炎1例，梗阻性腎病1例。20例患者隨機(jī)分為兩組，分別使用銅仿膜(CU，10例)和聚砜膜(PS，10例)透析，透析器均為首次用。研究過(guò)程中以下參數(shù)保持不變：血流量200 ml/min，透析液流量500 ml/min，透析液成份(Na+ 140 mmol/L,K+ 2 mmol/L,HCO3- 32 mmol/L，葡萄糖0 mmol/L)。另選20例慢性腎衰非透析患

10、者(男13例，女7例)，平均年齡(45.8±11.89)歲(2569歲)，平均血清肌酐水平為(778.65±279.01) mol/L(4501486 mol/L)。慢性腎衰的原發(fā)病為慢性腎小球腎炎16例，高血壓腎硬化2例，IgA腎病1例，尿酸性腎病1例。以上慢性腎衰病例全部排除糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、近期有肺部感染或有明顯全身性感染及其它免疫性疾病患者，且近兩個(gè)月內(nèi)未接受輸血、激素或免疫抑制劑的治療。10例正常對(duì)照(健康志愿者)，男5例，女5例，平均年齡(35.3±11.10)歲(2455歲)。二、實(shí)驗(yàn)方法1.標(biāo)本采集：血透組患者于單次透析開(kāi)始前自內(nèi)瘺及透析開(kāi)始

11、后5分鐘、30分鐘、180分鐘及300分鐘時(shí)分別從透析器流出端抽取血標(biāo)本(肝素抗凝20 U/ml)。慢性腎功能衰竭非透析組和正常對(duì)照組于試驗(yàn)當(dāng)天抽取肘靜脈等量血(肝素抗凝20U/ml)。以上取得標(biāo)本盡快進(jìn)行檢測(cè)。2.準(zhǔn)備白細(xì)胞：100 l抗凝血，分別加入FITC標(biāo)記單抗(抗CD11b、抗CD45、抗CD54或抗L-selectin)(Immunotech,France)各20 l，室溫孵育3045分鐘，加入溶血?jiǎng)┤芙饧t細(xì)胞，離心去上清，加PBS 4 ml(pH7.4)混勻，離心，加固定劑200 l，24小時(shí)內(nèi)分析。3.流式細(xì)胞分析：通過(guò)前向散射光和側(cè)向散射光開(kāi)窗(Gating)，利用細(xì)胞形態(tài)特

12、征和所含顆粒的性質(zhì)，將粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分開(kāi)。使用1024道對(duì)數(shù)放大器記錄平均熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率。使用熒光標(biāo)記的同型IgG作為陰性對(duì)照。所有樣品均在FACScan流式細(xì)胞儀和LYSYS-計(jì)算機(jī)軟件(Beckton-Dickinson,Mountain,View.CA.USA)上進(jìn)行分析，每個(gè)樣品分析10 000個(gè)細(xì)胞。4.細(xì)胞計(jì)數(shù)：常規(guī)手動(dòng)計(jì)數(shù)法。三、統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析處理數(shù)據(jù)(SAS軟件包6.04版本)，以P0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、CD11b在血透中的變化見(jiàn)表1、3。單次透析前粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面CD11b的基礎(chǔ)值與非透析組和

13、正常對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異(P0.05)。表1透析中粒細(xì)胞表面CD11b和CD45的表達(dá)情況時(shí)點(diǎn)(分鐘)CD11b(平均熒光強(qiáng)度)CD45(平均熒光強(qiáng)度)CU組PS組P值CU組PS組P值031.85±13.4131.32±17.890.0538.11±49.7227.44±18.780.05552.59±18.51*41.72±12.57*0.0562.53±70.4521.42±3.610.053053.67±19.98*38.10±19.78*0.0569.05±93.1720.0

14、1±3.640.0518043.43±13.74*30.64±17.910.0159.61±84.7724.67±18.180.0530036.77±13.1223.11±4.760.0573.42±88.8226.15±18.210.05注：CU組與PS組均為10例；與透析開(kāi)始0分鐘相比，* P0.05，* P0.01 透析開(kāi)始后5分鐘，CD11b的表達(dá)即迅速上升，然后逐漸下降，至透析結(jié)束時(shí)基本恢復(fù)到透前值(P0.05)，其中單核細(xì)胞上的上調(diào)程度低于粒細(xì)胞。比較CU膜和PS膜組；CU膜組粒細(xì)胞上CD11

15、b增加幅度明顯大于PS膜組(P0.05)，單核細(xì)胞上CD11b的變化兩組比較無(wú)差異。二、CD45在血透中的變化見(jiàn)表1、3。單次透析前單核細(xì)胞上CD45的基礎(chǔ)值和非透析組CD45的水平明顯低于正常對(duì)照組(P均小于0.05)；CU膜組較PS膜組和非透析組更低(P0.05)；粒細(xì)胞上CD45的透前基礎(chǔ)值與非透析組和正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P0.05)。單次透析開(kāi)始后CD45變化的動(dòng)力學(xué)改變類似于CD11b，但粒細(xì)胞上的變化與透前水平相比無(wú)明顯差異，而CU膜組單核細(xì)胞上CD45在透析5、30、300分鐘的值均明顯高于透前水平(P均小于0.05)。三、CD54在血透中的變化見(jiàn)表2、4。單次透析前粒細(xì)胞

16、和單核細(xì)胞上CD54的基礎(chǔ)水平與非透析組和正常對(duì)照組之間相比無(wú)差異；在單次透析過(guò)程中，兩種細(xì)胞上CD54的表達(dá)也無(wú)明顯差異，(P均0.05)。表2透析中粒細(xì)胞表面CD54和L-selectin的表達(dá)情況時(shí)點(diǎn)(分鐘)CD54(平均熒光強(qiáng)度)L-selectin(陽(yáng)性細(xì)胞率)CU組PS組P值CU組PS組P值016.81±4.9016.18±3.770.0551.72±34.4763.63±32.450.05525.96±23.8123.43±18.250.0523.81±25.08*56.84±34.260.05302

17、0.55±4.3416.12±6.140.0541.84±29.0365.35±30.650.0518023.75±10.2417.80±6.190.0547.07±35.8665.21±30.230.0530018.07±6.1516.27±4.900.0553.19±29.8774.07±25.240.05注：與透析開(kāi)始0分鐘相比，* P0.01；與正常對(duì)照組相比， P0.05 表3透析中單核細(xì)胞表面CD11b和CD45的表達(dá)情況時(shí)點(diǎn)(分鐘)CD11b(平均熒光強(qiáng)度)CD

18、45(平均熒光強(qiáng)度)CU組PS組P值CU組PS組P值041.79±11.5640.77±16.590.0555.30±30.05#105.86±44.540.05545.37±11.6947.49±16.55*0.05120.60±78.62*113.86±44.660.053045.76±16.0546.94±22.84*0.05120.46±69.98*122.64±49.590.0518044.12±16.1941.73±13.800.0587.77

19、±58.34116.21±42.830.0530037.58±14.1142.93±10.030.0591.37±50.23*113.47±43.910.05注：與透析開(kāi)始0分鐘相比，* P0.05，* P0.01；CU組與PS組相比， P0.05；與正常對(duì)照組相比， P0.05；與非透析組相比，# P0.05 表4透析中單核細(xì)胞表面CD54和L-selectin的表達(dá)情況時(shí)點(diǎn)(分鐘)CD54(平均熒光強(qiáng)度)L-selectin(陽(yáng)性細(xì)胞率)CU組PS組P值CU組PS組P值015.16±7.2612.18±6.52

20、0.0541.30±23.9246.87±21.590.05516.91±5.1112.16±7.300.0522.99±17.38*52.34±19.850.0013016.26±3.4412.67±7.050.0527.50±14.50*50.17±22.100.0518019.51±11.9815.47±13.680.0525.42±12.01*48.47±13.990.0530014.49±5.8816.51±14.550.05

21、39.41±17.7947.25±19.000.05注：與透析開(kāi)始0分鐘相比，* P0.05，* P0.01；與正常對(duì)照組相比， P0.05 四、L-selectin在血透中的變化見(jiàn)表2、4。單次透析前粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上L-selectin的基礎(chǔ)值明顯低于正常對(duì)照組(P均0.05)。非透析組L-selectin也低于正常對(duì)照組值(P0.05)。透析開(kāi)始，L-selectin的表達(dá)即迅速減少，隨后逐步回升，至透析結(jié)束時(shí)趨于透前水平。PS膜組與CU膜組相比，L-selectin的表達(dá)僅輕度下降，幅度明顯小于后者(P0.05)。五、血透中粒細(xì)胞和單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化見(jiàn)表5。單次透析

22、前，CU膜組粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常對(duì)照組，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)高于PS膜組，PS膜組的粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常對(duì)照組(P均0.05)。透析開(kāi)始后，外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)即明顯減少(P0.05)。30分鐘后開(kāi)始回升，至透析結(jié)束時(shí)基本接近透前值；CU膜組中細(xì)胞計(jì)數(shù)下降的幅度均明顯大于PS膜(P0.05)。表5血透中外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化情況(×109)時(shí)點(diǎn)(分鐘)粒細(xì)胞單核細(xì)胞CU組PS組P值CU組PS組P值04.70±1.284.65±1.590.050.38±0.120.23±0.100.0552.68±1.06#3.86±1.51*0.010.19&

23、#177;0.110.16±0.10*0.01303.19±1.44*3.95±1.72*0.050.18±0.06#0.20±0.100.0011804.90±1.444.33±1.990.050.31±0.160.22±0.120.053004.50±1.104.43±2.550.050.34±0.120.22±0.130.05注：與透析開(kāi)始0分鐘相比，* P0.05，* P0.01， P0.001，# P0.0005；CU組與PS組相比， P0.05；與正常對(duì)

24、照組相比， P0.05 討論血透患者中出現(xiàn)的補(bǔ)體激活、暫時(shí)性白細(xì)胞減少與肺通氣降低等癥狀，已知與透析膜的生物不相容性有關(guān)，這些變化又與長(zhǎng)期透析患者免疫力低下、感染、并發(fā)癥和病死率較高有關(guān)。其中透析激活白細(xì)胞，影響了白細(xì)胞的粘附功能可能與之密切相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，透析一開(kāi)始不久隨外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少，CD11b的表達(dá)迅速上升，L-selectin則很快下降。已知在血管內(nèi)皮上含有大量的L-selectin的配體，透析開(kāi)始時(shí)，粒細(xì)胞上的L-selectin能與之發(fā)生快速但不牢固的結(jié)合，使得粒細(xì)胞從血管內(nèi)血流中軸向內(nèi)皮靠近，并沿著內(nèi)皮緩慢向前滾動(dòng)4，此時(shí)激活的粒細(xì)胞上高表達(dá)的CD11b與內(nèi)皮上相應(yīng)配

25、體ICAM-1發(fā)生牢固的結(jié)合，使粒細(xì)胞固定在內(nèi)皮上，引起透析早期的粒細(xì)胞減少。單核細(xì)胞上也有類似的改變，因此外周血單核細(xì)胞也減少。最新的研究亦表明，血透可通過(guò)促使白細(xì)胞胞漿拉長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞表面某些粘附分子產(chǎn)生極化現(xiàn)象來(lái)促進(jìn)白細(xì)胞的聚集附著5。而L-selectin的表達(dá)下降可形成可溶性L-selectin，則可能降低白細(xì)胞的粘附能力。體外研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自透析患者的具有“高CD11b，低L-selectin”表型的白細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力明顯下降6。這使得粘附的白細(xì)胞快速解離下來(lái)，導(dǎo)致透析后期細(xì)胞計(jì)數(shù)的回升，并可能是機(jī)體防止粘附于內(nèi)皮上的白細(xì)胞發(fā)生進(jìn)一步變化的一條途徑。粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面粘

26、附分子水平的改變影響了白細(xì)胞與內(nèi)皮的粘附能力，不僅引起了上述細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變，而且可能減弱了白細(xì)胞的正常防御能力。已知白細(xì)胞與內(nèi)皮的粘附是機(jī)體發(fā)揮非特異性免疫機(jī)制中關(guān)鍵而基本的過(guò)程。CD11b和L-selectin參與了炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞的滲出、游走和殺死微生物等生理作用的發(fā)揮，并對(duì)上述反應(yīng)具一定的協(xié)同作用7，8。實(shí)驗(yàn)證實(shí)來(lái)自透析患者的具有“高CD11b，低L-selectin”表型的白細(xì)胞跨過(guò)炎癥部位的小靜脈內(nèi)皮進(jìn)入感染組織的能力明顯下降6，反映出該白細(xì)胞對(duì)趨化刺激反應(yīng)能力低下。盡管單次透析過(guò)程晚期CD11b和L-selectin的表達(dá)都基本恢復(fù)至透前水平，但透析是一個(gè)反復(fù)循環(huán)的過(guò)程，因此透析患

27、者的白細(xì)胞可能始終處于非正常狀態(tài)，其粘附吞噬病原體的能力可能都低于正常白細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體免疫能力的下降。而非透析者細(xì)胞表面L-selectin的表達(dá)也明顯低于正常對(duì)照組，提示尿毒癥毒素本身可能也影響白細(xì)胞的正常功能。比較透析使用銅仿膜和聚砜膜的患者細(xì)胞表面CD11b和L-selectin表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)兩組之間有顯著性差異(除單核細(xì)胞上CD11b外)，銅仿膜組變化更大，反映了聚砜膜激活白細(xì)胞、影響粘附分子表達(dá)的作用較小，提示它的生物相容性較好。在透析中白細(xì)胞表面CD45表現(xiàn)出與CD11b相似的動(dòng)力學(xué)改變。這種廣泛表達(dá)于白細(xì)胞表面的糖蛋白，參與了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程，能影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，調(diào)節(jié)細(xì)

28、胞表面CD11b和L-selectin的表達(dá)水平9。因此我們推測(cè)透析中CD45表達(dá)的變化，可能在白細(xì)胞受到激活引起粘附分子表達(dá)的改變過(guò)程中起到調(diào)節(jié)和(或)傳遞激活信號(hào)的作用。本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面CD54的表達(dá)在單次透析過(guò)程中無(wú)明顯變化，且透前基礎(chǔ)水平與正常對(duì)照組也無(wú)差別。CD54除在激活的白細(xì)胞上表達(dá)外，作為CD11b的配體還在血管內(nèi)皮上表達(dá)。已知在體外內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中CD54mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，由于無(wú)法在體內(nèi)對(duì)內(nèi)皮上CD54進(jìn)行檢測(cè)，因此我們估計(jì)內(nèi)皮上CD54分子的作用可能更有意義，這還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。總之，單次血透過(guò)程可激活粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，引起細(xì)胞表面

29、粘附分子有規(guī)律的變化，影響了外周血白細(xì)胞的計(jì)數(shù)，降低了白細(xì)胞的粘附吞噬能力，從而削弱了機(jī)體的免疫力，增加了感染的機(jī)會(huì)。其中銅仿膜的影響更大，提示其生物相容性較差。CD45在這一過(guò)程中能起到了調(diào)節(jié)和(或)傳遞激活信號(hào)的作用。本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金(39570341)和上海市高等學(xué)校科技發(fā)展基金(95B06)資助作者單位：錢家麒徐筱琪余志遠(yuǎn)200001上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟科；石學(xué)耕史桂英上海第二醫(yī)科大學(xué)生物物理教研室參考文獻(xiàn)1Canton AD.Adhesion molecules in renal disease.Kidney Int,1995,48:1687-1696.2Thomas ML,Lefrancois L.Differential expression of the leukocyte-common antigen family.Immunol Today,1988,320-326.3Mailloux LU,Bellucci AG,Wilkes BM.Mortality in dialysis patients:analysis of th