地紅霉素腸溶片釋放度測定方法的研究

1、地紅霉素腸溶片釋放度測定方法的研究 【摘要】 目的 對地紅霉素腸溶片釋放度測定的三種方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究和比較，并建立其最佳測定方法。 方法 分別采用 口 占 噸氫醇顯色法、硫酸顯色法以及高效液相色譜法測定地紅霉素腸溶片的釋放度，對每種方法進(jìn)行方法學(xué)的研究和驗證。 結(jié)果 采用三種方法均可以準(zhǔn)確地測定地紅霉素腸溶片的釋放度，不同方法測得結(jié)果差異較小。 結(jié)論 硫酸顯色法因試劑易得，操作簡便，快捷、準(zhǔn)確，將其作為最佳測定方法。 【關(guān)鍵詞】 地紅霉素 Study on methods for the release determination of dirithromycin entericcoated

2、 tablets ABSTRACT Objective Three methods by which the release of dirithromycin enteric-coated tablets were determinated and compared. Methods Xanthydrol coloring method，sulfuric acid coloring method，and HPLC method were developed for determination of the release of dirithromycin enteric-coated tabl

3、ets. Result All of these methods can be used to determine the samples precisely，and difference of the results among them is slightly. Conclusion Sulfuric acid coloring method is inexpensive，simple，rapid and precise，and it is regarded as the optimal method. KEY WORDS Dirithromycin; Enteric-coated tab

4、lets; Release 地紅霉素（dirithromycin）是一種新的第二代紅霉素類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由紅霉環(huán)胺與脂肪醛酸縮合而成。地紅霉素通過阻礙細(xì)菌轉(zhuǎn)肽過程，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。體外試驗證明地紅霉素對臨床上多種常見致病菌有抗菌作用。地紅霉素具有與紅霉素相似的抗菌譜，其特點是藥動學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，半衰期長達(dá)2050h，不良反應(yīng)相對較輕1，2 。美國Lilly公司的產(chǎn)品于1993年9月在西班牙上市，1996年通過美國FDA批準(zhǔn)，并收入美國藥典USP23。目前國內(nèi)有多家研制的地紅霉素腸溶片和腸溶膠囊獲準(zhǔn)生產(chǎn)并用于臨床。對于地紅霉素腸溶片釋放度的測定方法，美國藥典（USP23）中采用了 口 占

5、噸氫醇顯色法 3 ;我國的試行藥品標(biāo) 準(zhǔn)中采用了硫酸顯色法;另外，還可以采用含量測定的 HPLC法進(jìn)行釋放度的測定 4 。我們對這三種方法分別進(jìn)行了方法學(xué)研究，并對三種方法測得的結(jié)果進(jìn)行了比較。 1 儀器與試藥 1.1 儀器 ZRS-8型智能溶出試驗儀（天津大學(xué)無線電廠）;Shimadzu UV-2401PC型紫外-可見分光光度計;Shi-madzu高效液相色譜儀（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp可見紫外檢測器、SCL-10Avp控制器）;AE200電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。1.2 試藥 地紅霉素對照品（純度99.83%）為自制，并由中國藥品生物制品檢定所標(biāo)定;地紅霉

6、素腸溶片（規(guī)格:0.25g）為自制產(chǎn)品;10% 口 占 噸氫醇甲醇溶液購自北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉及硫酸等均為分析純。2 方法與結(jié)果 2.1 口 占 噸氫醇顯色法 在采用 口 占 噸氫醇顯色法測定本品釋放度的過程中發(fā)現(xiàn)，完全依照USP23中的顯色條件，方法的線性和耐受性不佳;經(jīng)過改良顯色條件，可使方法具有較好的線性和顯色穩(wěn)定性。其他條件如對照品溶液的濃度、檢測波長等則與USP23中條件相同。 2.1.1 美國藥典中的顯色條件 精密量取待測溶液0.50ml，加入0.50ml乙酐，混勻。然后加入5.0ml冰乙酸，靜置5min，加入0.50

7、ml 口 占 噸氫醇試液，放置30min使顯色。 2.1.2 改良后顯色條件 精密量取待測溶液1.0ml，加入0.10mol/L鹽酸溶液4.0ml，搖勻，再加 口 占 噸氫醇試液10.0ml，混勻，于沸水中加熱5min，于冰浴中冷卻，再于室溫放置15min。 口 占 噸氫醇試液的配制 取10% 口 占 噸氫醇甲醇溶液0.02ml，置100ml量瓶中，加冰乙酸20ml及鹽酸1ml，搖勻，用冰乙酸稀釋至刻度。 2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取地紅霉素對照品適量，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并分別稀釋成0.07、0.14、0.21、0.28、0.35、0.42、0.49和0.56mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)

8、溶液。分別精密量取1.0ml，按上述方法進(jìn)行顯色，測定540nm波長處吸收度。以吸收度A對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（mg/ml）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=1.8452C-0.0042，r=0.9998。 2.1.4 溶液室溫放置穩(wěn)定性試驗 取上述0.28mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫下放置，分別于0、1、2、4、6和8h精密量取1.0ml進(jìn)行顯色，測定。結(jié)果表明溶液的吸收度在4h內(nèi)變化不大。 2.1.5回收率試驗 精密稱取地紅霉素11、14及17mg，分別置50ml量瓶中，加入處方量的空白輔料，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾。分別精密量取續(xù)濾液1.0ml，按上述方法進(jìn)行顯色，于5

9、40nm波長處分別測定吸收度。計算測得量及回收率，結(jié)果見Tab.1。 2.1.6測定法 取本品，先以鹽酸溶液（91000）900ml為溶劑，采用籃法，轉(zhuǎn)速100r/min，經(jīng)2h，每片腸溶膜均不得有裂縫或軟化現(xiàn)象;繼以磷酸鹽緩沖液（pH6.8）900ml為溶劑，45min時取溶液10ml，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密稱取地紅霉素對照品適量，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解，并稀釋成0.28mg/ml的溶液，作為對照品溶液;精密量取上述溶液各1.0ml，加入0.10mol/L鹽酸溶液4.0ml，搖勻，再加入 口 占 噸氫醇試液10.0ml，混勻，于沸水中加熱5min，于冰浴中冷卻，再于室溫放

10、置15min。以空白試劑溶液作對照，于540nm波長處測定吸收度，以兩者的比值計算釋放百分率。2.2 硫酸顯色方法 采用顯色條件與地紅霉素腸溶片試行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的相同條件，即以（75100）硫酸液5ml為顯色試劑，室溫下反應(yīng)1h，檢測波長為482nm。 2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取地紅霉素對照品適量，用pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并分別稀釋成32、64、96、128和160g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取5.0ml，加入（75100）硫酸液5ml，搖勻，室溫下放置1h，測定482nm處吸收度。以吸收度A對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（g/ml）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=0.0064C-0.0766

11、（r=0.9993）。 2.2.2 溶液室溫放置穩(wěn)定性試驗 取上述96g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫下放置，分別于0、1、2、4、6和8h精密量取5.0ml，進(jìn)行顯色，測定。結(jié)果表明，溶液的吸收度在4h內(nèi)變化不大。 2.2.3 回收率試驗 精密稱取地紅霉素及處方比例的輔料，加pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解，過濾，分別稀釋成含地紅霉素80、100和120g/ml的溶液，分別精密量取5.0ml，按上述方法顯色，測定482nm處吸收度。計算測得量及回收率，結(jié)果三個劑量的回收率分別為99.6%、100.2%和99.1%，對應(yīng)的RSD分別為0.8%、0.6%和0.5%。 2.2.4 測定法 取本品，按照2.1.6

12、項下所述方法操作，取磷酸鹽緩沖液（pH6.8）為釋放介質(zhì)，45min后取溶液10ml，濾過，精密量取續(xù)濾液2ml，加入磷酸鹽緩沖液（pH6.8）稀釋至5ml，作為供試品溶液;另精密稱取地紅霉素對照品適量，用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解，并稀釋成100g/ml的溶液，作為對照品溶液;精密量取上述溶液各5.0ml，按2.2.4項下所述方法顯色，測定482nm處吸收度。以兩者的比值計算釋放百分率。 2.3 高效液相色譜法（HPLC法） 2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:Diamond-C 18 （4.6mm250mm，5m）;流動相:乙腈甲醇磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.41g與磷酸氫

13、二鉀6.91g，加水至1000ml）（441937）;檢測波長205nm;流速2ml/min;柱溫40;進(jìn)樣量10l。 系統(tǒng)適用性試驗依照USP23中地紅霉素腸溶片含量測定項下方法進(jìn)行。根據(jù)試驗結(jié)果規(guī)定，地紅霉素16R異構(gòu)體峰與9（S）紅霉胺峰之間分離度R12 不得小于5.0，地紅霉素16R異構(gòu)體峰與16S異構(gòu)體峰之間分離度R 23 不得小于2.0。 2.3.2 空白輔料及溶劑的干擾試驗 試驗結(jié)果表明，空白輔料及溶劑（pH6.8磷酸鹽緩沖液）均在2min之前出峰，不干擾樣品的測定。 2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取地紅霉素對照品適量，加pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解并分別稀釋成0.05、0.1

14、0、0.20、0.40和0.60mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取10l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，以峰面積A對濃度C（mg/ml）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:A=553934C+894.69（r=0.9999）。 2.3.4 溶液穩(wěn)定性及精密度 取上述0.20mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫條件下放置，分別于0、1、2、4和6h吸取10l，進(jìn)行測定，結(jié)果表明，6h內(nèi)峰面積變化不大，RSD為0.75%。0時連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，量取峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為0.66%。 2.3.5 回收率試驗 精密稱取地紅霉素及處方比例的輔料，加pH6.8磷酸鹽緩沖液溶解，過濾，分別稀釋成含

15、地紅霉素0.20、0.25和0.30mg/ml的溶液，分別吸取10l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法計算測得量及回收率。結(jié)果表明，三個劑量的回收率分別為100.0%，99.7%和99.4%，對應(yīng)的RSD分別為0.5%、0.6%和0.5%。 2.3.6 測定法 分別吸取2.1.6項下所述供試品溶液和對照品溶液10l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法計算釋放百分率。2.4 供試品釋放曲線的繪制 取地紅霉素腸溶片6片，依據(jù)中國藥典2005年版 二部附錄X D釋放度測定法第二法，采用籃法，先以鹽酸溶液（91000）900ml為溶劑，轉(zhuǎn)速100r/min，經(jīng)2h，每片腸

16、溶膜均不得有裂縫或軟化現(xiàn)象;繼以pH6.8磷酸鹽緩沖液（900ml）為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100r/min。分別于5、10、20、30、45和60min取樣，分別精密量取續(xù)濾液適量，按上述三種方法分別處理溶液，并測定數(shù)據(jù)，計算每片在緩沖液介質(zhì)中的釋放量，每個時間點均以測得的六片釋放量均值作為該時間點的釋放量，繪制釋放曲線，并比較不同測定方法所得釋放曲線間差異（Fig.1）。結(jié)果表明，用上述三種釋放度測定方法測得的地紅霉素腸溶片的釋放曲線基本一致。 3 討論 （1）比較上述三種地紅霉素腸溶片的釋放度測定方法， 口 占 噸氫醇顯色法為美國藥典中規(guī)定的方法，操作繁瑣，且顯色試劑國內(nèi)沒有生產(chǎn)，必須進(jìn)口;硫

17、酸顯色法為我國試行藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法，優(yōu)點為試劑易得，操作簡便快捷;HPLC法為參考美國藥典中地紅霉素腸溶片含量測定方法建立的，優(yōu)點為準(zhǔn)確，靈敏度高，但所需時間較長，成本較高。 （2）三種方法均具有較高的準(zhǔn)確度，所測得的釋放曲線間差異較小。但綜合考慮，硫酸顯色法成本較低，操作方便，為地紅霉素腸溶片釋放度測定的最佳方法。 （3）采用上述三種方法測得的自制地紅霉素腸溶片45min的釋放量均達(dá)標(biāo)示量的100%左右，說明該制劑的釋放性能良好。 （4）USP23規(guī)定的方法中， 口 占 噸氫醇是采用的固體，而國內(nèi)僅有其10%的甲醇溶液銷售，因此，上述 口 占 噸氫醇顯色法中采用了10% 口 占 噸氫醇甲醇溶液，方法學(xué)研究表明，這種變動不會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1田德光，