復(fù)方中藥“克瘤寧”對(duì)人食管癌的抗癌作用及其機(jī)理研究

1、復(fù)方中藥“克瘤寧”對(duì)人食管癌的抗癌作用及其機(jī)理研究【關(guān)鍵詞】 克瘤寧/藥理學(xué) 摘 要：目的：探討復(fù)方中藥“克瘤寧”對(duì)人食管癌的抗癌作用及其機(jī)理。方法： 應(yīng)用光鏡、透射電鏡，觀察復(fù)方中藥“克瘤寧”誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞凋亡的作用； 用“克瘤寧”對(duì)移植人食管癌8d后的裸鼠進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)共分五組：“克瘤寧”高濃度組（2.4g/kg）、中濃度組（1.2g/kg）、低濃度組（0.6g/kg）、陽(yáng)性對(duì)照組（平陽(yáng)霉素15mg/kg）和陰性對(duì)照組（生理鹽水）?！翱肆鰧帯惫辔附o藥，每天一次，連續(xù)給藥36次，平陽(yáng)霉素腹腔注射給藥，每3d一次，共給藥12次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)二次。結(jié)果： 經(jīng)“克瘤寧”處理的EC10

2、9細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡特征； 克瘤寧高、中、低三劑量在裸鼠體內(nèi)對(duì)食管癌的抑瘤率分別為：66.36%76.85%(P0.01)、54.21%55.56%(P0.01)、38.32%39.81%(P0.01)，陽(yáng)性對(duì)照平陽(yáng)霉素在裸鼠體內(nèi)對(duì)食管癌的抑瘤率為51.40%56.48%(P0.01)。結(jié)論： “克瘤寧”有誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的作用，這可能是“克瘤寧”抗食管癌作用的重要機(jī)理； 在裸鼠可耐受的劑量下，“克瘤寧”對(duì)裸鼠移植的人食管癌有明顯抗癌作用，且隨著劑量增加，其抗癌療效增加。關(guān)鍵詞： 克瘤寧/藥理學(xué)； 食管腫瘤/中藥療法； 動(dòng)物疾病模型； 裸 鼠Antitumor Effect of

3、Zhenhuang Capsule on Human Esophageal Carcinoma and its MechanismsAbstract： Objective： To investigate the antitumor effect of Zhenhuang capsule(ZHC) on human esophageal carcinoma and research its mechanisms. Methods： Apoptosis induced by ZHC in human esophageal carcinoma cell line EC109 was investig

4、ated by light microscopy, transmission electron microscopy combined with flow cytometry analysis technique. A perfusing test with ZHC was conducted on nude mice 8 days after the human esophageal carcinoma transplantation. The animals were divided into 5 groups: high ZHC dose group (2.4g/kg, BW), med

5、ium ZHC dose group (1.2g/kg), low ZHC dose group (0.6g/kg), positive control group of Pingyangmycin (15mg/kg) and saline control group. ZHC was perfused into stomach, once daily, with 36 times consitituting one course. Pingyangmycin was injected intraperitaneously, once every three days, 12 times co

6、nsitituting one course. The test was repeated 2 times.Results： After exposure to ZHC, EC109 cells manifested typical apoptotic features. The tumor-inhibiting rates of the high, medium and low dose ZHC groups ranged from 66.36% to 76.85%(p0.01), 54.21% to 55.56%(p0.01) and 38.32% to 39.81%(p0.01), re

7、spectively. The tumor-inhibiting rate of the Pingyangmycin group ranged from 51.40% to 56.48%(p0.01). Conclusion： ZHC induces apoptosis of esophageal carcinoma cells and ZHC induced apoptotsis possibly the primary mechanism of ZHC for treatment of esophageal carcinoma. ZHC has significant antitumor

8、effect on human esophageal carcinoma transplanted into nude mice receiving tolerance doses. The effect increase with elevation of dose.Key words： Zhenhuang capsule/pharmacodynamics； Esophagus neoplasms / TCD therapy； Animal disease models； Nude mice本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)和裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩途徑，研究“克瘤寧”對(duì)人食管癌的抗癌作用，旨在從細(xì)胞凋亡的角度探討“

9、克瘤寧”治療食管癌的作用機(jī)理。1 材料和方法1.1 細(xì)胞株：人食管癌細(xì)胞株EC109，取材于河南省林州食管癌病人手術(shù)標(biāo)本，建株于1975年。1.2 藥物：“克瘤寧”（復(fù)方中藥），由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院黃新蘇醫(yī)生研制。平陽(yáng)霉素，天津河北制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：19990310。1.3 試劑和儀器：細(xì)胞培養(yǎng)基PRMI-1640（BIBCO-BRL公司產(chǎn)品），小牛血清（廣州三源生物制品公司產(chǎn)品），MTT（四甲基偶氮唑）（Sigma公司產(chǎn)品），DMSO（二甲基亞砜）（日本）。倒置相差顯微鏡，Olympus/BM-6顯微鏡（日本），酶標(biāo)儀（DG3022A），透射電子顯微鏡（Philips EM-410）

10、，流式細(xì)胞儀（Coulter，Elite-ESP），CO2培養(yǎng)箱（Revco美國(guó)）。1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/C nu/nu裸鼠，鼠齡6周8周，體重18g23g，由廈門(mén)大學(xué)抗癌中心裸鼠室提供（動(dòng)物合格證號(hào)：閩實(shí)動(dòng)質(zhì)準(zhǔn)第009號(hào)，SPF級(jí)），動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF環(huán)境下（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)，粵醫(yī)動(dòng)字第26-004號(hào)，SPF級(jí)），裸鼠所需的物品、飲水、標(biāo)準(zhǔn)飼料均須經(jīng)高壓蒸汽消毒后方可使用。1.5 實(shí)驗(yàn)方法1.5.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：在96孔培養(yǎng)板上常規(guī)接種細(xì)胞，每孔接種細(xì)胞數(shù)為2105。藥物分5個(gè)劑量組，濃度按K值為0.66等比稀釋，最高劑量為80ug/ml。每劑量設(shè)三個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)

11、24h后，加入不同濃度的“克瘤寧”提取液（由“克瘤寧”復(fù)方提取而成），繼續(xù)培養(yǎng)96h，培養(yǎng)結(jié)束前4h加入濃度為0.5mg/ml的MTT100ul（用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋）繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去培養(yǎng)液，加DMSO 100ul溶解沉淀物，振蕩后在酶標(biāo)儀上測(cè)量吸光度值（波長(zhǎng)為570nm），按公式：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組吸光度-實(shí)驗(yàn)組吸光度）/對(duì)照組吸光度。計(jì)算各劑量組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，求出IC50。1.5.2 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡：根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)40ug/ml藥物處理24h后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。1.5.3 電鏡觀察細(xì)胞凋亡：取

12、經(jīng)離心后收集的細(xì)胞，用PBS液洗2次，計(jì)數(shù)5106個(gè)細(xì)胞，用2.5%茂二醛溶液固定細(xì)胞45min，再用1% OsO4固定1h，脫水，并用618樹(shù)脂包埋2h后，作超薄切片，經(jīng)常規(guī)染色后進(jìn)行電鏡觀察。1.5.4 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：用我們建立的人食管鱗狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤模型(Eca910709)第52代移植瘤做瘤源。取新鮮癌組織2mm2mm2mm置含青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中備用,接種于裸鼠背部皮下同一部位,每鼠接種一塊。移植成功率100%。待移植瘤長(zhǎng)至d8，約3mm直徑時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為五組，然后開(kāi)始治療?！翱肆鰧帯备邼舛冉M、中濃度組、低濃度組：分別按2.4g/kg、1.2g/kg、0.6g/kg灌胃給藥，每天一次，每次0.2ml,共36次；陽(yáng)性對(duì)照（平陽(yáng)霉素組）：按15mg/kg腹腔注射給藥，每3d一次，每次0.2ml,共12次；陰性對(duì)照組：給生理鹽水灌胃，每天一次，每次0.2ml,共36次。末次給藥后24h，處死動(dòng)物,剝瘤稱重。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)均按上述方法進(jìn)行。2 結(jié)果2.1 在培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)不同濃度珍黃注射液處理的EC109細(xì)胞，其生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度相關(guān)，呈現(xiàn)出明確的量效關(guān)系，24h、48h、72h測(cè)得的IC50值分別為40.4ug/ml、35.1ug/ml、32.6ug/ml（表1）。表1 “克瘤寧”提取液對(duì)人食管癌細(xì)胞EC