尼莫地平對(duì)鋁損傷大鼠腦組織MAOB表達(dá)的影響

1、尼莫地平對(duì)鋁損傷大鼠腦組織MAOB表達(dá)的影響    【摘要】  目的 觀察鋁負(fù)荷大鼠腦組織單胺氧化酶B(MAOB)的活性與表達(dá)改變，并探討尼莫地平對(duì)該動(dòng)物模型的影響。方法 采用三氯化鋁（AlCl3）(400 mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5 d/w，持續(xù)3個(gè)月，建立鋁負(fù)荷致大鼠慢性腦損傷的動(dòng)物模型，尼莫地平(80 mg/kg)在每次鋁給予4 h后灌胃，觀察行為學(xué)、生化酶學(xué)、MAOB mRNA及蛋白表達(dá)水平等指標(biāo)的變化。結(jié)果 鋁負(fù)荷能明顯導(dǎo)致大鼠被動(dòng)回避性

2、學(xué)習(xí)記憶能力和空間識(shí)別能力障礙，使其腦組織乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性顯著降低(P0.01)，而膽堿酯酶(AchE)活性顯著升高(P0.01)，超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低(P0.01)，而丙二醛（MDA）含量顯著升高(P0.01)，MAOB活性與MAOB mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增加(P0.01)；NMDP能明顯改善鋁負(fù)荷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力障礙，明顯阻遏鋁負(fù)荷大鼠海馬組織ChAT與SOD活性的降低，AchE活性與MDA含量的增高，MAOB活性及其mRNA與蛋白表達(dá)的增加。結(jié)論 鋁負(fù)荷致大鼠腦損傷涉及腦組織的MAOB活性與表達(dá)改變；NMDP可能降低鋁負(fù)荷大鼠腦組

3、織MAOB表達(dá)和活性，并增加SOD活性，減少自由基而保護(hù)大鼠慢性腦損傷。 醫(yī)學(xué)論文網(wǎng)【關(guān)鍵詞】  尼莫地平；鋁負(fù)荷大鼠；單胺氧化酶BEffect of nimodipine on the MAOB expression in rat brain injuried by aluminum    ZHONG Liang，ZHANG Jing，YANG JunQing,et 

4、;al.    Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics，Ministry of Education，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China    【Abstract】  Objective  To study the chang

5、e of MAOB activity and expression in brain tissue of aluminumoverload rat and the effect of nimodipine on this animal model.Methods  The chronic brain injury model o

6、f rats were established by intragastric administration of aluminum trichloride (400 mg/kg) once daily，5 d/w for 3 months，and nimodipine (80 mg/kg) was intragastrically administered 

7、;4 h following aluminum administration.The changes of behavior，biochemical enzyme and the expression of MAOB mRNA and protein in rat brain tissue were observed.Results  Aluminumove

8、rload markedly induced impairments of avoidant learning and memory function and spatial distinguish function in rats，while ChAT activities significantly decreased (P0.01), but AchE acti

9、vities increased (P0.01)，SOD activities significant decreased (P0.01), but MDA contents increased (P0.01)，MAOB activities and expression of MAOB mRNA and protein significantly increased in&#

10、160;rat brain tissue (P0.01).Conclusions  The change of MAOB activity and expression in brain tissue is involved in brain injury induced by aluminumoverload rat.Nimodipine has 

11、;an obvious protective effect against chronic brain injury.The mechanism of the protective effect may be related to the decreasing of MAOB activities and expression，increasing of&#

12、160;SOD activities in bran tissue of aluminumoverload rat，thus leads to reduce the free radical.    【Key words】  Nimodipine；Aluminumoverload rat；Monoamine oxidase B   

13、60;  由于阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)病機(jī)制未明，目前尚缺乏理想的治療手段。尼莫地平是雙氫吡啶類鈣通道拮抗劑，脂溶性高，易通過(guò)血腦屏障，其擴(kuò)張腦血管，改善腦血供應(yīng)等作用已得到肯定并應(yīng)用于臨床，而其對(duì)老年癡呆認(rèn)知記憶障礙的改善作用1，機(jī)制至今仍不很清楚。有研究報(bào)道單胺氧化酶B（MAOB）的活性改變與神經(jīng)元損傷和神經(jīng)元退變可能有密切關(guān)系2，3。為探討尼莫地平在改善老年癡呆等導(dǎo)致的認(rèn)知記憶障礙中的作用，本研究擬采用鋁負(fù)荷大鼠腦損傷模型，觀察腦損傷學(xué)習(xí)記憶障礙與腦組織MAOB改變的關(guān)系及尼莫地平對(duì)鋁損傷大鼠腦組織MAOB表達(dá)的影響，為神經(jīng)元退行性疾病的發(fā)病機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)，

14、為防治藥物的開發(fā)探尋新方法與新途徑。    1  材料與方法    1.1  動(dòng)物與分組  清潔級(jí)3月齡Wistar大鼠100只，雄性，180220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2005002。按體重隨機(jī)分成3組，每組10只，即空白對(duì)照(溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉)組，鋁模型(AlCl3 400 mg/kg)組與尼莫地平組(80 mg/kg)，灌胃容積1 ml/100

15、 g體重。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，鋁模型組死亡2只鼠。    1.2  方法    1.2.1  試劑、藥品與儀器  AlCl3·6H2O和葡萄糖酸鈉為國(guó)產(chǎn)分析純，臨用前用蒸餾水配制；尼莫地平(重慶科瑞制藥廠)，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配制；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、膽堿脂酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、MAOB試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RTPCR試劑盒（日本TaKaRa）、RNATriol、單去污劑裂

16、解液、考馬斯亮藍(lán)、封閉液與辣根過(guò)氧化物酶等。DTT2 型大鼠跳臺(tái)儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、DMS2 型電腦全自動(dòng)程控Morris 水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)、UV265紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)gene cycleTM，BioRad公司)與凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國(guó) BioRad公司)等。    1.2.2  模型制備  采用AlCl3(400 mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5&

17、#160;d/w，持續(xù)3個(gè)月，建立鋁負(fù)荷致大鼠慢性腦損傷的動(dòng)物模型。    1.2.3  檢測(cè)指標(biāo)    1.2.3.1  訓(xùn)練次數(shù)與跳臺(tái)潛伏期  分別在給予藥物3月后次日，用跳臺(tái)法測(cè)定每組大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力。先將動(dòng)物放入反應(yīng)箱中適應(yīng)1 min，然后通以電壓為36 V的交流電5 min，大鼠遭受電擊會(huì)跳上安全平臺(tái)，而走下平臺(tái)后會(huì)再次遭受電擊，記錄5 min內(nèi)大鼠受電擊次數(shù)，作為大鼠學(xué)會(huì)逃避電擊的學(xué)習(xí)能力。24

18、 h 后測(cè)定大鼠的記憶成績(jī)，把大鼠置于安全平臺(tái)上，記錄大鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間即潛伏期，以此潛伏期作為大鼠的記憶成績(jī)，超過(guò)5 min記為5 min。    1.2.3.2  尋臺(tái)潛伏期  每組大鼠在完成被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試后，用Morris水迷宮法進(jìn)行大鼠空間定向能力測(cè)試。水溫2425。整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程分為2個(gè)階段：第1 階段，第1次訓(xùn)練時(shí)將大鼠放到平臺(tái)上適應(yīng)1 min，后讓其自由游泳至平臺(tái)，3 min內(nèi)未找到平臺(tái)者，實(shí)驗(yàn)者協(xié)助將其引至平臺(tái)，從

19、第2天起，每天分上、下午分段訓(xùn)練，每段訓(xùn)練4 次，每次訓(xùn)練時(shí)選擇1 個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠進(jìn)行定向航行，持續(xù)訓(xùn)練4 d；第2階段，即在第5 天時(shí)進(jìn)行測(cè)試，撤去平臺(tái)，并任意將大鼠從最后一次訓(xùn)練時(shí)的入水方位放入，電腦記錄大鼠第1次跨越原平臺(tái)的時(shí)間即尋臺(tái)潛伏期(Step down latency，SDL)，以此潛伏期作為大鼠的空間定向能力成績(jī)，超過(guò)2 min以2 min計(jì)算。    1.2.3.3  腦組織ChAT、AchE 、SOD

20、 活性和MDA含量測(cè)定  在完成全部行為學(xué)測(cè)試后，處死大鼠，分離其海馬，用生理鹽水做成10%勻漿，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行具體操作。    1.2.3.4  腦組織MAOB活性、mRNA及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)  10%海馬及皮質(zhì)組織勻漿各取0.1 ml，按照MAOB 試劑盒說(shuō)明書中的操作步驟測(cè)定MAOB活性。參照大鼠MAOB基因庫(kù)，根據(jù)cDNA設(shè)計(jì)引物，引物由北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心合成，用來(lái)擴(kuò)增535 bp的MAOB 片段。另外從北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)

21、展中心購(gòu)買GAPDH引物一對(duì)作為內(nèi)參照，用來(lái)擴(kuò)增983 bp 的GAPDH片段。MAOB的上游引物為5TGCTAGATAAGATCTGCTGG3；下游引物為5ATCCAATGTGTACGCAATTG3；GADPH的上游引物為5 TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC3；下游引物為5CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3；PCR反應(yīng)條件為95 5min預(yù)變性，95 1 min、60 55 s與72 90 s，27 個(gè)循環(huán)，72 10 min。

22、擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳，BioRad凝膠成像分析系統(tǒng)成像與分析。Western印跡測(cè)定MAOB蛋白表達(dá)水平，以actin為參照，辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)顯    色，用可見紫外光凝膠掃描分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。    1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  結(jié)果用x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間差異采用Dunnet t方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。    2  結(jié)  果&#

23、160;   2.1  鋁負(fù)荷大鼠腦組織生化指標(biāo)的變化及尼莫地平的影響  與空白對(duì)照組比較，鋁模型組大鼠腦組織的ChAT與SOD活性明顯降低，AchE活性與MDA含量顯著增高（均P0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠腦組織的ChAT與SOD活性明顯增加，AchE活性與MDA含量顯著降低（均P0.01）（表1）。    2.2  鋁負(fù)荷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的變化及尼莫地平的影響  與空白對(duì)照組比較，鋁模型組大鼠5 min內(nèi)學(xué)會(huì)逃避電擊而

24、需要的電擊次數(shù)明顯增加，而跳臺(tái)潛伏期明顯縮短，尋臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)（均P0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠學(xué)會(huì)逃避電擊而需要的次數(shù)明顯減少(P0.01)，而跳臺(tái)潛伏期明顯延長(zhǎng)，尋臺(tái)潛伏期明顯縮短（均P0.01）（表2）。    2.3  鋁負(fù)荷致大鼠腦組織MAOB 活性與表達(dá)變化及尼莫地平的影響  與空白對(duì)照組比較，鋁負(fù)荷組大鼠腦組織MAOB活性與MAOB mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增高（均P0.01）。與鋁模型組比較，尼莫地平組大鼠腦組織MAOB活性與MAOB mRNA及蛋白表達(dá)

25、均顯著降低（均P0.01）（表3）。表1  尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷大鼠腦組織ChAT、AchE、SOD活性與MDA含量的影響表2  尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與空間識(shí)別能力損害的影響與鋁模型組比較：1）P0.01，下表同表3  尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB活性與 表達(dá)的影響    3  討  論    轉(zhuǎn)基因方法可以建立AD大鼠模型，并能較好地模擬AD特征改變，但建模時(shí)間長(zhǎng)，成本昂貴，很難廣泛用于研

26、究4。動(dòng)物腦室注射、腹腔給予或者長(zhǎng)期口服鋁鹽，鋁可在腦皮層各區(qū)以及海馬異常沉積，引起動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的進(jìn)行性損害和神經(jīng)元退變5。因此，本室采用AlCl3(400 mg/kg)持續(xù)灌胃大鼠的方法，建立鋁負(fù)荷致大鼠慢性腦損傷模型。ChAT的表達(dá)和活性降低以及AchE活性的升高會(huì)造成乙酰膽堿含量下降，進(jìn)而出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙。因此ChAT和AchE表達(dá)和活性改變是AD等神經(jīng)元退行性疾病特征變化之一。本研究中，鋁模型組大鼠腦組織ChAT活性降低，AchE活性升高，同時(shí)大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力與空間識(shí)別能力損害，故此法建立神經(jīng)元退變大鼠模型是成功的。   

27、60;關(guān)于鋁致神經(jīng)毒性，特別是致神經(jīng)元退變的機(jī)制，目前尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性鋁負(fù)荷可導(dǎo)致大鼠海馬SOD活性降低、MDA含量升高，提示與其他原因所致腦損傷相似，氧化應(yīng)激也參與了慢性鋁負(fù)荷致腦損傷、神經(jīng)元退變過(guò)程。    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB活性、MAOB mRNA與蛋白表達(dá)顯著增高，提示鋁負(fù)荷致大鼠神經(jīng)元退變的毒性機(jī)制也與MAOB活性及表達(dá)增加有關(guān)。    本結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，尼莫地平能明顯改善鋁負(fù)荷導(dǎo)致的大鼠被動(dòng)回避性學(xué)習(xí)記憶能力損害和空間學(xué)習(xí)記憶障礙，減輕海馬神經(jīng)元損傷，明顯增加鋁負(fù)荷大鼠海馬ChAT與SOD的活性，明顯降低鋁負(fù)荷大鼠AchE活性與MDA含量，表明尼莫地平對(duì)鋁負(fù)荷大鼠腦損傷具有保護(hù)作用；同時(shí)，尼莫地平也能顯著降低鋁負(fù)荷大鼠腦組織MAOB活性，對(duì)抗鋁負(fù)荷引起的大鼠腦組織MAOB mRNA和蛋白表達(dá)