國內(nèi)的溶菌酶的應(yīng)用與發(fā)展陳邱

1、國的溶菌酶的應(yīng)用與發(fā)展溶菌酶,又稱胞壁質(zhì)酶。球蛋白 G、N - 乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。 最早對溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年發(fā)表的枯草芽孢桿菌中的 溶解子,1922 年 Flem ing 等發(fā)現(xiàn),在人的唾液、眼淚中存在有能夠溶 解細(xì)胞壁殺死細(xì)菌的酶 ,因而被命名為溶菌酶 1 。1965 年,英國的菲 利普等用 X 衍射法對溶菌酶進(jìn)行研究分析 ,第一個(gè)完全弄清了溶菌酶 的立體結(jié)構(gòu) 2 。此后人們發(fā)現(xiàn)溶菌酶廣泛地存在于高等動(dòng)物組織及 分泌物，植物及各種微生物中 ,其中在新鮮的雞蛋清中含量最高。溶 菌酶可選擇性地分解微生物細(xì)胞壁的同時(shí)不破壞其它組織,且本身無毒無害 ,因而它是一種天

2、然的安全性能很好的殺菌劑 ,防腐劑,將可應(yīng)用 于食品防腐、醫(yī)藥制劑 日用化工等行業(yè)。在我國 ,溶菌酶的應(yīng)用圍和 應(yīng)用量還比較有限 ,但可以預(yù)計(jì)，溶菌將會(huì)是應(yīng)用于我國食品工業(yè)中 一種重要的功能性食品添加劑。溶菌酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和抗菌作用機(jī)制結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與復(fù)雜性 大多數(shù)雞蛋清溶菌酶是由 129 個(gè)氨基酸組成的堿性球狀蛋白 ,相 對分子量在 1400018000。其等電點(diǎn)可達(dá) 107,存在 4 個(gè)二硫鍵。正常條件下溶菌酶作用的最適溫度為 45C50C。蛋清溶菌酶 在低溫干燥下可長期保存。其純品為白色粉末狀結(jié)晶,無臭、味甜 ,易溶于低濃度的食鹽水。在堿性條件下易被破壞,但在酸性溶液中其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性很

3、強(qiáng)，在 pH47 時(shí),100C下處理 1m in 酶仍保持良好的活性，在 pH3 時(shí),100C加熱處理 45m in 仍能保持活 性3。溶菌酶在水溶液中 6215C下維持 30min 則完全失活，在 2015%的乙醇中，在 6215C下維持 20m in 而不失活4。王瑋等5研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的穩(wěn)定性均隨著醇濃度的 增大而提高。 人溶菌酶分子量為 14600,由 130 個(gè)氨基酸組成 ,也存在 4 個(gè)二硫鍵 ,其酶活性比雞蛋清溶菌酶高 2 倍左右。在生產(chǎn)或應(yīng)用溶菌 酶時(shí),由于工藝或環(huán)境的變化 ,極易造成酶的變性失活 ,因此必須采取一 定的手段使蛋白復(fù)性，減少損失。史晉輝

4、等 7研究發(fā)現(xiàn) ,當(dāng)酶濃度較 低時(shí), 0 1 7mol/L的鹽酸胍即可使溶菌酶完全復(fù)性。此外 , 溶菌酶和其 它酶具有相似的性質(zhì) ,Karupp iah 等8研究表明 ,向復(fù)性溶液中加入 適量的B-環(huán)糊精，可使變性的碳酸脫水酶的復(fù)性率達(dá)到 80%。董曉燕 等9利用B-環(huán)糊精和十六烷基三甲基溴化的聯(lián)合作用，在適宜鹽酸胍 濃度下 ,溶菌酶可完全復(fù)性。王彥等利用離子交換色譜法研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)復(fù)性緩沖液中不含其它鹽類時(shí) ,脲濃度為 210mol/L 時(shí)復(fù)性產(chǎn)率最高 , 當(dāng)脲濃度高時(shí) ,硫酸銨能很好地提高溶菌酶的復(fù)性回收率。 溶菌酶的抗菌作用機(jī)制目前已知的幾種溶菌酶有：-N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶B-1,3

5、、性 1,6 葡聚糖酶和甘露聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸甘露糖酶脫、乙酰殼多糖酶 11。參與細(xì)菌細(xì)胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分為作用于糖苷鍵和 作用于肽和酰胺部分的兩類。-N -乙酰己糖胺酶、B- 1,3、B1, 6 葡聚糖酶等主要作用于糖苷鍵 ,使糖苷鍵斷裂 ,破壞細(xì)胞壁的分子結(jié)構(gòu) , 而酰胺酶等則主要作用于多肽 ,使多肽斷裂。以 - N - 乙酰己糖胺酶 為例,- N- 乙酰己糖胺酶能夠催化水解細(xì)胞壁肽聚糖分子中的 N- 乙酰胞壁酸(NAM )與 N-乙酰葡萄糖氨(NAG)之間的1,4 糖苷鍵，使肽聚糖分子發(fā)生斷裂 ,使細(xì)胞壁外兩側(cè)滲透壓失衡 ,造成細(xì)胞破裂 ,導(dǎo)致 微生物因細(xì)胞壁溶解而被殺死

6、12氏陽性菌由于兩者細(xì)胞壁中肽聚糖 含量不同而存在差異，G+細(xì)胞壁含 80%太聚糖，而 G-細(xì)胞壁只有在壁 層含有少量肽聚糖。結(jié)晶法是傳統(tǒng)的提取溶菌酶的方法 ,此方法原料易得 ,制備過程不是很 煩瑣。起先 M ayerAbraham 等研究并利用此法 ,于 1937 年獲得結(jié)晶 狀物質(zhì) 13,1945 年 A lderton 等提出直接結(jié)晶法制備溶菌酶的方法 14。景芝等 15對傳統(tǒng)結(jié)晶法做出了改進(jìn) ,通過調(diào)整透析液 pH 值 , 加入磷酸鹽 ,再調(diào)整其 pH 值,然后離心去除雜質(zhì)得到純化液 ,使產(chǎn)率提 高,活性增加。離子交換層析法 離子交換層析法是根據(jù)各種蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)的不同而與離子交換

7、劑之間結(jié)合力的差異 ,進(jìn)而將不同蛋白質(zhì)分離的技術(shù)。該法應(yīng)用于溶 菌酶分離始于 80 年代 ,由于其操作簡便、高效、成本低、 可自動(dòng)化連 續(xù)操作的優(yōu)點(diǎn) ,一直以來都是溶菌酶生產(chǎn)的常用方法 16 。目前國外常 用的離子交換劑有 Duolite - 464 、724、732 弱酸性陽離子交換樹脂、D903、201 大孔離子交換樹脂、羧甲基纖維素( CMC ) 和羧甲基瓊脂糖等 17。宋宏新等 18采用 724 樹脂,裝柱后抽提液緩慢流入柱中 , 用緩沖液洗滌，再用硫酸銨洗脫 ,結(jié)果表明 724 樹脂的吸附率達(dá)到 8315%。由于 Duolite - 464 非常適合于連續(xù)自動(dòng)化操作 ,因此利用它來

8、分離純化溶菌酶 ,可取得較高的產(chǎn)率。如 LiChan 等 19用 Duolite-464 從性質(zhì)均一的蛋清溶液中分離溶菌酶，使溶菌酶的回收率達(dá) 90 %95 %。親和層析法親和層析法是根據(jù)酶與作用底物的特異性親和能力,利用酶分子獨(dú)有的專一性結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分離方法20。它的應(yīng)用始于上世紀(jì) 70 年 ,由于底物可以專一性與溶菌酶結(jié)合 ,進(jìn)而與其它蛋白分離 , 是一種高效的分離方法。目前利用親和層析法分離溶菌酶的報(bào)導(dǎo)很 多,如HeLZ 等21采用多步親和層析法分離純化溶菌酶 ,結(jié)果表明 ,利 用三親和過濾系統(tǒng)從原料中純化溶菌酶 ,與一步法相比產(chǎn)率從 61%提 高到 96%。超濾 超濾是一種新興

9、分離純化技術(shù) ,利用控制超濾膜孔徑大小來濾過雜質(zhì) ,水及小分子物質(zhì)可以通過 ,從而獲取產(chǎn)物。在反滲析及濃縮等工藝中 廣泛應(yīng)用 ,同時(shí)在蛋白質(zhì)分離中應(yīng)用也開始興起。與傳統(tǒng)生化分離技 術(shù)相比 ,它的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品的產(chǎn)出量高、雜質(zhì)少、純度相對較高。在 2000 年,GhoshR等22采用小型的中空纖維超濾系統(tǒng)（30 kDa MWCO ,聚 砜膜）從蛋清干粉中分離溶菌酶 ,溶菌酶選擇性透過膜 ,而其它大分子 蛋白質(zhì)被膜所截留。溶菌酶的粗提液經(jīng)過超濾技術(shù)后,有時(shí)部分雜質(zhì)如無機(jī)離子等未能全部除去若將超濾與結(jié)晶法,或是與離子交換法等結(jié)合將取得精制溶菌酶。鄒艷麗等 23報(bào)道,超濾濃縮溶菌酶經(jīng) CM -Sephar

10、ose FF 陽離子交換柱后，純度提高 2119 倍。灝等24研究表明,將磷酸鹽緩沖液稀釋 10 倍，在 24M Pa 下均質(zhì)利用截留相對分子質(zhì)量 為30000 的聚醚砜（PES 膜進(jìn)行超，溶菌酶制品活力達(dá)到14610U/mg溶菌酶活性的測定目前 ,國外對溶菌酶活性的測定方法 ,主要有比濁法、紫外分光光度法、 比色測定法、瓊脂火箭糖電泳法和高效液相色譜法等 ,但上述各種方 法中均存在一定的缺點(diǎn) ,如比濁法干擾因素多 ,重復(fù)性差 ,對單個(gè)樣品 測定速度快 ,比色法操作簡單但誤差較大 ,因此 ,各種方法都在不停改 進(jìn)中。傳統(tǒng)方法測定溶菌酶活性時(shí)要將溶微球菌制成凍干粉,此過程不僅步驟煩瑣而且易造成細(xì)

11、菌大量死亡 ,影響結(jié)果。 玉萍等 向溶壁微 球菌直接加保護(hù)劑 （20%的甘油 ）置于普通采取了類似的方法。采用聚 苯乙烯微量反應(yīng)板 ,建立了微量快速比濁檢測溶菌酶的方法 , 使標(biāo)本 用量減少 ,反應(yīng)時(shí)間縮短 ,靈敏度較好。近年來 ,許多報(bào)道采用標(biāo)記乙二 醇化幾丁冰箱冷凍 ,使用時(shí)解凍 ,讀第 1min 的吸光度值和第 2min 的 吸光度值即可。使溶菌酶的測定方法更加節(jié)約高效 ,準(zhǔn)確性又好。 溶菌酶在食品、生物醫(yī)藥等工業(yè)中的應(yīng)用 溶菌酶作為一種天然蛋白質(zhì) , 能在胃腸被消化和吸收 ,對人體無毒 害作用 ,是一種安全系數(shù)很高的食品保鮮劑、營養(yǎng)保健品和藥品。由 于溶菌酶具有良好的理化特性 , 具有

12、一定的保健作用 , 如在化妝 品中用可消除粉刺 , 使皮膚滑嫩 ,促進(jìn)皮膚的新代謝 ; 有止血 促進(jìn)組織再生的作用 , 如在牙膏中添加可防止牙齦出血、保護(hù)牙齦 并具有殺菌作用。因此溶菌酶的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛 , 在食品、醫(yī)藥、 生物工程等方面都具有很大的應(yīng)用前景。此外 ,溶菌酶除作為醫(yī)藥原 材料外 ,僅在食品防腐、強(qiáng)化方面市場就比較可觀, 如乳制品、肉制 品、酒類發(fā)酵、 水果防腐等方面。 隨著對溶菌酶的研究的深入和應(yīng)用 產(chǎn)品的不斷開發(fā) ,溶菌酶一旦被人們認(rèn)識(shí)接受 ,其對市場的占有率將大 幅提高。溶菌酶在食品中的應(yīng)用溶菌酶在乳制品中的應(yīng)用 人乳與牛乳的最大差別之一在于溶菌酶的含量,在歐洲溶菌酶已經(jīng)

13、廣泛用于嬰兒食品添加劑 ,將一定量的溶菌酶添加到牛乳及其制品中,使牛乳人乳化，能夠強(qiáng)化血清滅菌蛋白，Y球蛋白等防御因子，抑制腸 道中腐敗性細(xì)菌的增殖 ,增強(qiáng)嬰兒對病菌的抵抗力。因此 ,在牛乳或奶 粉中添加一定量溶菌酶 ,不但防腐 ,而且強(qiáng)化營養(yǎng) ,有利于嬰兒健康成 長。此外 ,在奶酪產(chǎn)業(yè)溶菌酶也被廣泛使用 ,如在干酪生產(chǎn)中替代硝酸 鹽,加入01001%的溶菌酶 ,可防止干酪產(chǎn)氣 ,保持香味物質(zhì)丁酸。德國 于 1995 年11 月 22 日發(fā)布了奶酪法規(guī) ,批準(zhǔn)使用溶菌酶來阻止在半硬 奶酪的生產(chǎn)中由厭氧孢子增殖所引起的脹氣現(xiàn)象。 溶菌酶在肉制品中的應(yīng)用 低溫肉制品由于口感鮮嫩 ,營養(yǎng)豐富 ,獲得

14、消費(fèi)者的喜愛。但由于肉類 冷藏的溫度 ,并不能徹底殺死微生物或抑制其生長,因而保鮮期短 ,不能滿足消費(fèi)者需求。溶菌酶本身無毒、無害,可替代如苯甲酸及其鈉鹽等化學(xué)防腐劑添加到肉制品中 ,能有效延長食品保質(zhì)期。采用 0105%溶菌酶和 0105% N isin 混合液保鮮豬肉，4C下可保鮮 12d,真空包裝保鮮期可達(dá) 24d。在此基礎(chǔ)上添加了 18% NaCI 和 415% 葡萄糖組成復(fù)合保鮮劑 ,用于小包裝分割冷卻肉的保鮮 ,保質(zhì)期明顯提 高。同樣，曾友明等將溶菌酶與 N isin、復(fù)合磷酸鹽、茶多酚、酪朊酸鈉組成復(fù)合保鮮劑與鮮肉混合 ,制成鹽水火腿 ,其保質(zhì)期可達(dá) 3 個(gè) 月。同時(shí) ,溶菌酶在

15、紅腸的加工 ,延長其貨架期方面的報(bào)道也非常多。 總體上溶菌酶在肉制品上的保鮮作用已經(jīng)得到認(rèn)可,并且取得了不少的進(jìn)展 ,各種相關(guān)工作也在廣泛展開。 溶菌酶在海產(chǎn)品和水產(chǎn)品保鮮上的應(yīng)用研究采用0105%的溶菌酶、115%甘氨酸和 3%的食鹽溶液中將海產(chǎn)品或水產(chǎn)品浸漬 5m in, 瀝干水 分,常溫下保存 9d 后無異味、無色澤變化溶菌酶的使用 ,極大提高了 海產(chǎn)品或水產(chǎn)品的保鮮期 ,對其儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)葞砹撕艽蟮姆奖?。溶菌酶在低度酒及飲料中的?yīng)用 在低度酒中添加溶菌酶不僅對酒的風(fēng)味無任何不良影響,還可防止產(chǎn)酸菌生長 ,是低度酒良好的防腐劑。在日本清酒部分微生物不能生存,但有一種叫做火落菌的乳酸菌則能生

16、長，并產(chǎn)酸使酒發(fā)臭,添加溶菌酶后火落菌被有效抑制 ,成功代替水酸作防腐劑用于清酒中，向葡萄 酒中加入一定量的溶菌酶 ,可以大大減少 SO2 的使用量 ,減小了 SO2 使用過多可能對人體造成的毒害作用。 溶菌酶在基因工程和酶工程上的應(yīng)用 隨著生物科學(xué)的發(fā)展 ,溶菌酶已成為基因工程及酶工程中必不可少的 工具酶 ,用以制造和提取菌體的活性物質(zhì)如核酸 ,酶及活性多肽等 利 用其專一性水解細(xì)胞壁的特點(diǎn) ,有助于人們對細(xì)胞壁細(xì)微結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí) , 為我們深入研究細(xì)胞壁的構(gòu)造打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ) ,同時(shí)作為是一種重 要的破壁酶 ,在原生質(zhì)體的制備方面提供了新的方法 ,因此溶菌酶被廣 泛應(yīng)用于生物技術(shù)、 生物工程中

17、。 溶菌酶在抗菌消炎、 增強(qiáng)免疫力方 面的應(yīng)用溶菌酶對 G+ 、枯草桿菌等有很好的殺滅作用 ,對大腸桿菌、 普通變球菌等 G- 也具有一定程度溶解。此外 ,溶菌酶與抗菌素合用 效果更佳。因而 ,溶菌酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè) ,如利用溶菌酶治療各種 五官科炎癥 ,尤其對急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等 效果明顯 。溶菌酶在多種疾病診斷方面的應(yīng)用 ,正常情況下 ,人體尿液中一般只存 在少量溶菌酶 ,因此測量尿中溶菌酶含量 ,有助于檢測腎小管功能障礙 性疾病。同時(shí) ,燒傷病人分泌的溶菌酶比常人多出幾倍 ,也可在尿液中 檢出 ,有助于對手術(shù)移植排斥、 燒傷嚴(yán)重程度的判斷。 此外, 血清中溶 菌酶

18、含量高低對白血病的診斷起輔助作用。 首先把血清溶菌酶水平的 測定作為白血病分型的依據(jù) ,提供了診斷急性白血病的新方法。我國溶菌酶的生產(chǎn)應(yīng)用現(xiàn)狀及前景隨著環(huán)境的污染日益嚴(yán)重 科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和人民生活水平的提高 ,人們對食品和醫(yī)藥的安全性 要求越來越高 ,許多對某些化學(xué)防腐劑已限制使用 ,因此高效、安全、 具有天然活性成分的溶菌酶勢必倍受人們的關(guān)注。目前,國外對溶菌酶進(jìn)行了較深入的研究 ,我國對溶菌酶的研究、應(yīng)用起步較晚 , 雖然 相繼開展了一些有關(guān)溶菌酶提取和應(yīng)用方面的研究工作 , 但與發(fā)達(dá) 相比溶菌酶制造業(yè)規(guī)模小、設(shè)備和生產(chǎn)技術(shù)相對落后。當(dāng)前,國外主要從蛋清中提取溶菌酶 ,因?yàn)閺牡扒逯刑崛∪芫?/p>

19、酶 ,是一項(xiàng)生產(chǎn)相對簡 單、投資較少、見效快的工程 ,對于畜產(chǎn)品深加工、綜合利用 ,均有巨 大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蛋清溶菌酶在國外已于 20 世紀(jì) 80 年代進(jìn)入規(guī)模 化生產(chǎn),上世紀(jì) 90年代末以來 ,已形成近千噸的市場規(guī)模 ,溶菌酶生產(chǎn)廠家主要分布在歐美亞等地。 其中丹麥、 加拿大占世界市場的一半以上,由于我國生物酶工程研究起步比較晚 ,我國于 20 世紀(jì) 80 年代對 蛋清溶菌酶技術(shù)開始研究 ,已多次列為 “863 ”計(jì)劃及“十五計(jì)劃”等 的重點(diǎn)科研攻關(guān)項(xiàng)目。目前國已投產(chǎn)的蛋清溶酶 ,才能達(dá)到有效的防 腐效果。其次 ,為了更好的發(fā)揮溶菌酶防腐作用 ,可以與其它物質(zhì)配比 使用。如甘氨酸和溶菌酶的配比使