充血性心力衰竭患者T淋巴細胞功能失調(diào)的探討

1、充血性心力衰竭患者T淋巴細胞功能失調(diào)的探討陳冰雪 王玲玲 劉莉 王鳳飛 曹曉敏關鍵詞：充血 【摘要】 目的 探討充血性心力衰竭（Congestive Heart lailure CHF）患者外周血輔助性T淋巴細胞功能失調(diào)及其在心力衰竭發(fā)生及發(fā)展中的意義。方法 選擇62例充血性心力衰竭患者作為實驗組，并按照紐約心臟病協(xié)會（NYHA）分為心功能級（28例），心功能級（16例），心功能級（18例），另選30例健康志愿者作為對照組。采用流式細胞分析法，檢測所有被檢者外周血CD4 細胞胞內(nèi)細胞因子干擾素（IFN-）和白細胞介素4（IL-4）的表達。同時分離外周血單核細胞（PBMC），經(jīng)植物血凝素（PHA

2、）刺激培養(yǎng)后，應用酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）檢測培養(yǎng)上清液中IFN-和IL-4水平。結(jié)果 充血性心力衰竭組患者IFN-染色陽性的細胞占CD4 T細胞的比率為17.48%，明顯高于對照組的12.09% 。IL-4染色陽性細胞比率在兩組間未見顯著統(tǒng)計學差異。ELISA檢測顯示心力衰竭組培養(yǎng)上清液中IFN-水平及IFN-/IL-4比值明顯高于對照組，而兩組間IL-4水平則無顯著統(tǒng)計學意義。結(jié)論 心力衰竭患者輔助性T淋巴細胞功能與心功能之間有一定關系，且與心功能級別呈正相關。輔助性T淋巴細胞功能失調(diào)可能參與了CHF患者的心室重構過程?！娟P鍵詞】 心力衰竭；T淋巴細胞；細胞因子；干擾素；白細胞介素4

3、The investigation of cell-mediated immunity function imbalance in patients with congestive heart failure【Abstract】 Objective To explore the significance of cell-mediated immunity function imbalance in patients with congestive heart failure.Methods Six-two patients with congestive heart failure were

4、included and divided into 3 groups according to the New York Heart Association (NYHA),thirty healthy men were studied as control. The heart function was evaluated by two-dimensional echocardiography. Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) were collected from these patients.Cytokine-producing CD4

5、T cells were quantified by 3-color flow cytometry after bring stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) and ionomyccin. After being stimulated with PHA, the levels of IFN- and IL-4 in culture supernatants were measured by ELISA.Results The frequencies of IFN-producing T cells were found to be

6、significantly higher in congestive heart failure group(17.48%) than that in control group(12.09%). There was no significant difference on the frequencies of IL-4-producing peripheral T-lymphocytes between the two groups. The IFN- level and the ratios of IFN-/IL-4 in congestive heart failure group we

7、re significantly higher than that of control. While there was no significant difference in IL-4 level between the two groups.Conclusion The cell-mediated immunity function was associated with heart function in patients with congestive heart failure. The up-regulation of T cell function was consisten

8、t with poor heart function, suggesting that cell-mediated immunity function imbalance may participate in ventricular remodeling after heart failure. 【Key words】 heart failure;T-lymphocytes;cytokines;interferon-gamma;interleukin-4隨著人口老齡化，高血壓及冠心病等心血管疾病急性病死率顯著降低，作為大多數(shù)心血管疾病的最終轉(zhuǎn)歸-充血性心力衰竭 (Congestive hear

9、t failure, CHF)日益成為嚴重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。積極探討CHF的發(fā)生發(fā)展機制 ,可為CHF的防治提供強有力的理論指導。在過去的30年中，由于心力衰竭治療學的深入進展，心力衰竭的病死率雖已明顯下降；但仍有資料顯示，心力衰竭的發(fā)病率仍未得到有效控制，CHF患者在心血管疾病入院治療的比率中仍占到1/4以上1。最近的研究證實，受損的心臟可以釋放或暴露正常隱蔽的抗原成分，從而觸發(fā)針對心肌細胞的自身免疫應答反應，導致心室重構和心肌進一步損傷。輔助性T淋巴細胞功能失衡被認為與自身免疫性疾病的發(fā)病有密切關系2。本研究通過對CHF患者外周血輔助性T淋巴細胞功能檢測，探討輔助性T淋巴細胞

10、功能失調(diào)在CHF發(fā)生與發(fā)展過程中的作用。1 資料與方法1.1 研究對象 收集自2004年1月2005年10月在我院住院的CHF患者62例，其中男44例，平均年齡（62.432.8）歲，女18例，平均年齡（58.328.4）歲；按美國紐約心臟學會（NYHA）心功能分級標準，級28例，級16例，18例；其中冠心病38例，風濕性心臟病18例，擴張性心肌病6例。均無急慢性感染、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、風濕活動及半年內(nèi)急性心肌梗死。各級心力衰竭組年齡、性別、病種比較差異無顯著性。對照組：選擇性別、年齡與實驗組相匹配的健康人30例，男18例，女12例，年齡(56.36.8)歲。均為經(jīng)詢問病史、體格檢查及常

11、規(guī)輔助檢查排除器質(zhì)性疾患的健康人。 有以下情況均剔除：合并腦卒中、嚴重的肝腎功能不全者；周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病者；惡性腫瘤患者和風濕性疾病患者。此外，合并感染性疾病如：敗血癥、嚴重的上呼吸道感染、肺部或肝膽道感染等、高熱以及應用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇及鴉片類藥物等均予以剔除。1.2 研究方法1.2.1 標本收集 每例CHF患者于住院后靜脈采血5ml，2ml用于流式檢測，3ml用于細胞培養(yǎng)，肝素鈉抗凝。1.2.2 流式細胞內(nèi)細胞因子檢測 取兩只試管，分別為測定管和陰性對照管。每管加入肝素抗凝全血100l和RPML-1640培養(yǎng)基礎100l。加入刺激劑佛波乙醇酯（PMA）2

12、5ng，離子霉素(ionomycin)1g和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑莫能霉素(monensin)4l。375%二氧化碳培養(yǎng)箱5h?；靹?，各取100l。均加入5PE-cy5標記的鼠抗人CD4單抗。4避光孵育20min。加1ml溶血素裂解紅細胞，室溫10min，離心棄上清，PBS洗滌1次。加入500l破膜劑進行細胞打孔利于細胞因子單抗進入細胞，離心棄上清后進行胞內(nèi)細胞因子染色。測定管中加入5l FITC標記的IFN-/PE標記的IL-4單抗，對照管加入相應的熒光標記對照抗體，4避光孵育20min,PBS洗滌一次后上機檢測。上述主要試劑均購自BD公司。應用流式細胞儀FACSCALIBUR型。根據(jù)前向散射光和

13、側(cè)向散射光以淋巴細胞群設門，對第一通道和第二通道分別以相應的同種型IgG染色細胞為陰性對照，設置各通道之間的熒光補償后，對CD4 細胞分泌的Th1型細胞因子IFN-和Th2型細胞因子IL-4進行檢測。1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）細胞因子檢測 淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,用含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整細胞濃度為1.5106/ml，加入植物血凝素（PHA）100mg/L,37,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清儲存于20用于細胞因子檢測。采用ELISA方法，所用操作步驟均按照說明

14、書進行。干擾素（IFN-）和白介素4（IL4）檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司，IFN-最低檢測值15.625ng/L,IL-4最低檢測值8ng/L。1.3 統(tǒng)計學方法 所有資料均以(xs)表示，應用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。作方差齊性檢驗（levene檢驗），方差分析（F檢驗），多個均數(shù)間的兩兩比較用q檢驗，以P0.05為有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 兩組患者臨床資料的比較 對照組和CHF組患者的年齡、性別和冠心病危險因素差異均無統(tǒng)計學意義。其中對照組男18例，女12例，合并高血壓9例，合并高脂血癥7例。心力衰竭組男44例，女18例，合并高血壓31例，合并高脂血癥16例，合并糖

15、尿病9例。CHF患者與對照組臨床資料的比較見表1。表1 CHF患者與對照組臨床資料的比較 (略)注：與對照組比較，*P0.05；TC：總膽固醇；LDLC：低密度脂蛋白膽固醇；HDLC：高密度脂蛋白膽固醇；TG：甘油三酯2.2 CHF患者與對照組心功能指標的比較 與對照組相比，心力衰竭組患者出現(xiàn)明顯的左室擴張和收縮功能受損（表2），表現(xiàn)為左室舒張末期直徑（LVEDd）明顯增大，左室射血分數(shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）顯著降低。表2 CHF患者與對照組心功能的比較 (略)注：與正常對照組比較，*P0.052.3 CHF組與對照組CD4細胞胞內(nèi)因子的表達 二者的差別見表3。表3 CHF組與對照組

16、CD4細胞（略）注：與正常對照組比較，*P0.05與對照組比較，CHF組患者的IFN染色陽性的細胞占CD4細胞的比例明顯增高，而IL-4染色陽性細胞比例在兩組間差異無統(tǒng)計學意義。2.4 CHF組與對照組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-及IL-4濃度差別 見表4。表4 CHF組與對照組PBMC培養(yǎng)（略）注：與正常對照組比較，* P0.05與對照組比較，CHF組患者的PBMC培養(yǎng)上清液中Th1型細胞因子-IFN-水平及IFN-/IL-4比值明顯增高，而Th2型細胞因子IL-4水平在兩組間差異無統(tǒng)計學意義。3 討論在CHF的發(fā)生發(fā)展中，除了通過Frank-Starling機制和神經(jīng)體液裝置的過度代償機制

17、外，心室重構是其主要病理學機制3。自身免疫所致的炎癥性反應在心室重構過程中的作用正日益受到學者的關注。有學者觀察到在CHF的大鼠模型中，大鼠心肌有大量淋巴細胞浸潤和血管周圍炎，說明大鼠體內(nèi)發(fā)生了細胞免疫應答為主的自身免疫反應4。T淋巴細胞在自身免疫性炎癥中起重要作用?，F(xiàn)代免疫學認為，活化的輔助性T淋巴細胞按其功能和分泌細胞因子的不同至少可以分為兩群：Th1細胞可以分泌IFN-而不分泌IL-4，主要介導細胞免疫應答；Th2細胞可以分泌IL-4而不分泌IFN-，主要介導體液免疫應答，通常以這兩種細胞因子作為鑒別Th1和Th2的標志5。ELISA方法對PBMC群體一段時間內(nèi)釋放細胞因子總和進行檢測，

18、而三色法流式細胞術檢測胞內(nèi)細胞因子在單個細胞水平區(qū)分Th1/Th2細胞，兩者均可作為分析Th1/Th2亞型的依據(jù)6。Th1/Th2細胞出現(xiàn)功能失衡和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關系。Th1細胞功能亢進可促進某些器官特異性自身免疫病，如1型糖尿病的發(fā)展；Th2細胞功能亢進可促進全身性自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)展。研究中我們發(fā)現(xiàn)CHF患者體內(nèi)出現(xiàn)Th1細胞功能明顯高于對照組，表明其功能亢進，而且持續(xù)時間較長，提示該功能亢進可能繼發(fā)于CHF后的心肌炎癥反應，并推測CHF患者Th1細胞功能亢進可能是CHF病理性自身免疫應答的發(fā)生機制之一，參與CHF和心室重構過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，CHF患者的Th細胞功能與心功能有一定關系，Th1細胞功能與心功能等級呈明顯正相關，表現(xiàn)為IFN-染色陽性的細胞占CD4T細胞的比例以及PBMC培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子IFN-水平及IFN-/IL-4比值的明顯增高，提示Th1細胞功能亢進對CHF后心力衰竭的