多角度激光光散射與GPC聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)

1、63006300HollisterArenueSantaSantaBarbara.CA93117CA93117TEL(8O5)68V9C09TEL(8O5)68V9C09FAX(S05J6813123FAX(S05J6813123,att-ooni,att-ooni. .URLhttp;/ww*r.wyattcoHiURLhttp;/ww*r.wyattcoHi多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀聯(lián)接與應(yīng)用技術(shù)MALLS/GPC(SEC)WYATTTECHNOLOGYCORPORTION(BEIJINGOFFICE)地址：北京西直門(mén)北大街58號(hào)金暉嘉園7-2302美國(guó)懷雅特技術(shù)公司北京代表處郵編：

2、100082電話：8610-82292806傳真：8610-82290337CORPORATIONCORPORATION多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀的聯(lián)接與應(yīng)用WYATTTECHNOLOGYCORPORATION.一前言近十幾年來(lái)，光散射技術(shù)(Lightscattering)在高分子特征分析領(lǐng)域的應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。將光散射技術(shù)和凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography,GPC或尺寸排阻色譜(SizeExclusionChromatography)分離技術(shù)相結(jié)合，不但可以測(cè)得大分子的絕對(duì)分子量，分子旋轉(zhuǎn)半徑與第二維里系數(shù)，還可測(cè)得分子量分布，分辨分子量大小不同

3、的族群以及分子的形狀，分枝率及聚集態(tài)等。目前，該技術(shù)已成為一種非常有效的工具，在美國(guó)，日本及歐洲已廣為使用，國(guó)內(nèi)近年來(lái)亦引進(jìn)了此項(xiàng)技術(shù)。二光散射簡(jiǎn)介早在十九世紀(jì)初，人們就開(kāi)始對(duì)光散射原理進(jìn)行研究。自六十年代激光被發(fā)明以來(lái)，光散射的原理與技術(shù)使得以迅速發(fā)展，至今已成為檢測(cè)微小粒子形狀，粒徑大小，分子量，界面電位及粒子間效應(yīng)的重要工具。隨著電腦技術(shù)的日新月異，許多過(guò)去需花費(fèi)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)日才能完成的實(shí)驗(yàn)，如今只需數(shù)分鐘即可完成，而其準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性也大幅度提高了。光散射現(xiàn)象，如圖1所示，當(dāng)一束光通過(guò)一間充滿煙霧的房間就會(huì)產(chǎn)生散射。利用在不同角度，不同時(shí)間所測(cè)得的光散射強(qiáng)度，再借助各種光學(xué)理論及軟件，硬

4、件設(shè)備，就可以測(cè)得微粒的許多特性。入射光散射光圖1光散射現(xiàn)象在光散射發(fā)展的歷程中，以下是一些具有代表性的人物:JamesClerkMaxwell(1833-1879)解釋了光是一種電磁波，并正確地計(jì)算出光的速度。LordRayleigh(1842-1919)文案大全研究了遠(yuǎn)小于波長(zhǎng)的微粒散射現(xiàn)象， 發(fā)現(xiàn)了散射強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方成反比， 并解釋了藍(lán)天被太陽(yáng)光穿透大氣層所產(chǎn)生的散射現(xiàn)象。AbertEinstein(1879-1955)研究了液體的光散射現(xiàn)象。AChandrasekharaV.Raman(1888-1970)印度籍物理大師，提出了Raman效應(yīng)，具著作多次發(fā)表于印度文期刊，直至第二次

5、世界大戰(zhàn)結(jié)束后才逐漸被人所知。PeterDebye(1884-1966)延續(xù)了Einstein的理論，描述了分子溶解于溶劑中所產(chǎn)生的光散射現(xiàn)象，提出用Debyeplot,求得重量平均分子量Mw三光散射理論激光照射到樣品時(shí)，會(huì)在各個(gè)方向產(chǎn)生散射光，于是我們可以在一個(gè)角度或多個(gè)角度收集散射光的強(qiáng)度。1 .光散射所透露的信息在任何方向的光散射強(qiáng)度與分子量和溶液的濃度成正比； 散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關(guān)。當(dāng)分子小于10nm時(shí)，各個(gè)角度的散射強(qiáng)度都相同；當(dāng)分子介于10至30nm時(shí)，散射強(qiáng)度則由低角度向高角度呈直線下降的趨勢(shì)；而當(dāng)分子大于30nm時(shí)，散射強(qiáng)度則隨角度增大呈曲線下降的趨勢(shì)。2 .基

6、本理論由Maxwell,Einstein,Debye及Zimm等人陸續(xù)發(fā)展起來(lái)，有關(guān)溶劑中分子量的光散射現(xiàn)象可由下列公式表達(dá)：K*c1=+2A2cR(DMwPG(1)式中：常數(shù)k=4兀2(dn/dc)2n02(NA入04)n。是溶劑的折光指數(shù)。C是溶質(zhì)分子的濃度(g/mol)。NA是阿佛加德羅常數(shù)。入。是入射光的波長(zhǎng)。DN/DC是溶液折射率與濃度變化的比值，它說(shuō)明了隨溶質(zhì)濃度變化的溶液折光指數(shù)變化。R()是單個(gè)角度的散射光(大于溶劑的散射光數(shù)量)除以入射光強(qiáng)度所得的分?jǐn)?shù)即不同角度光散射強(qiáng)度。Mwll重均分子量。A是第二維里系數(shù)P(是光散射強(qiáng)度的函數(shù)將已代入式()展開(kāi)得:在上式中，R()是測(cè)得值

7、，K*c、入0、為輸入值，均為已知值？而MwMrg為未知值。3.ZimmPlot將K*C/Re對(duì)sin2(q/2)+kc作圖，可得到著名的Zimm曲線，如圖2所示，其中K為調(diào)整橫坐標(biāo)的設(shè)定值。圖2ZimmPlo當(dāng)8一。時(shí)，(2)式簡(jiǎn)化為斜率即是AK*=-1+2A2cR(0)M當(dāng)8一O,C-0,(2)式簡(jiǎn)化為K*1R(0)M在縱座標(biāo)上交點(diǎn)的倒數(shù)即為Mw實(shí)驗(yàn)的方法為配制一組不同濃度的溶液， 依次在不同的角度測(cè)量其散射光強(qiáng)度，由計(jì)算機(jī)程序按照上列的公式繪出ZimmPlot,并求得Mw的2及A值，這是極少數(shù)能直接測(cè)得絕對(duì)分子量的方法之一。但由于結(jié)果僅為單一平均值，I6r當(dāng)C-0時(shí)，(2)式簡(jiǎn)化為斜率是

8、rg2sin(0/2)+kc因此較適用于成分單一，分布較窄的分子，對(duì)于分布較寬或有不同族群分布的樣品，則較難看出全貌。四光散射與GPC/SECGPC/SE3以將溶劑中的分子按重量或尺寸大小依次洗脫出來(lái)。利用此項(xiàng)技術(shù)將光散射儀器與GPC/SECM用，除了可以分出不同的族裙，還可測(cè)得不同族群的分布，并且不需要另外標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 由于光散射信號(hào)直接與分子量大小有關(guān)， 因此可以直接測(cè)出重均絕對(duì)分子量，并獲得其它許多有關(guān)的信息。錯(cuò)誤！2.010.012.014.016.0Volume(mL)圖4光散射強(qiáng)度與GPC!析圖18.020.05050505011oo11oorpcnveDVO9XUAChr

9、omatographywithLSSet-upPumpOColumnsColumnsPlumbingElectricalFilterInjectorDAWN-EOSorminiDAWNDAWN-EOSorminiDAWN圖5光散射強(qiáng)度與GPC/SEO用1Debyeplot通常GPC/SEC勺樣品注射濃度就很低，再經(jīng)過(guò)色譜柱得到進(jìn)一步的稀釋，圖4中光散射信號(hào)上的任何一點(diǎn)，其濃度都極低(趨近于零)。根據(jù)公式，當(dāng)2A2c-0,將K*C/Re對(duì)sin2(q/2)+kc作圖6,其縱坐標(biāo)交點(diǎn)即為1/Mw,由直線的斜率可得到入2,圖4光散射信號(hào)的每點(diǎn)都可以得到上述結(jié)果，由此可以求得分子量及旋轉(zhuǎn)半徑八2的分布

10、，如圖7所示：圖6Debyeplot*HEPARIN211.5圖7分子量對(duì)洗脫體積作圖logr* *LT1LT1L LT2T2LT3LT3LT4LT41.0 x101.0 x103 31.0 xl01.0 xl0J J1.0 x101.0 x10s s1.0 x1051.0X101.0 x1051.0X107 7MolarMass(g/mol)MolarMass(g/mol)圖8積分分子量2分子形狀不論是分布較寬或是多峰分布的樣品， 皆可通過(guò)測(cè)量分子量及分子旋轉(zhuǎn)半徑得到分子形狀的數(shù)據(jù)。球形分子門(mén)300MTogri=k+1/3logM無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀分子ri200MTogm=k+1/2logM棒狀分

11、子ri100M-10gri=k+1/1logM將10gri,logM作圖，有直線的斜率可以獲知分子的形狀，如圖9所示:CumulativeMolarMassCumulativeMolarMassM匚口君ELTH6一S焉0.5-0.6)圖9-1M、rg與分子形狀的關(guān)系MolarMass(g/mol)9-2構(gòu)型判斷，rg對(duì)MW作圖。斜率為0.54土0.01。表明分子是具有無(wú)規(guī)則線團(tuán)構(gòu)象的線性聚合RMSRadiusvs.MolarMassGATC2_010.54?0.011.0 x1041.0 x1051.0 x1061.0 x107100.0RMSRadiusvs.MolarMassGATD401

12、0.68?0.04GATD5010.69?0.041.0 x1061.0 x10MolarMass(g/mol)1.0 x106MolarMass(g/mol)9-3構(gòu)型判斷，rg對(duì)MW作圖。斜率大于0.6,表明分子具有伸展結(jié)構(gòu)。斜率為1.0,表明是棒狀100.0RMSRadiusvs.MolarMassGATE20110.01.0 x101.0 x10_51.0 x1051.0 x104圖9-4構(gòu)型判斷，rg對(duì)MW作圖。其U型曲線表明為典型的高支化度結(jié)構(gòu)。3需要量多少個(gè)角度在低角度的時(shí)候，有雜質(zhì)所產(chǎn)生的噪音信號(hào)干擾會(huì)很大，如圖10所示，所以只取低角度，加上九十度兩個(gè)角度，其誤差就會(huì)相對(duì)很大；

13、若只取九十度則只能求得分子量，無(wú)法測(cè)得旋轉(zhuǎn)半徑，所以最起碼要加上一組高角度來(lái)修正，則誤差會(huì)較少很多。4光散射儀器最基本的儀器miniDAWTREOS口圖11所示，在與入射光成45度、90度、135度角配置三組光電二極管檢測(cè)器，同時(shí)檢測(cè)不同角度的光散射強(qiáng)度，而激光經(jīng)由樣品槽的毛細(xì)管通道，樣品槽為石英材質(zhì)。如果要增加測(cè)量角度，可以如DAWNHELEOS在樣品槽的兩側(cè)以不對(duì)稱得方式增加檢測(cè)器的數(shù)目，如圖12所示可高達(dá)18個(gè)角度之多。五應(yīng)用光散射強(qiáng)度與分子的大小及分子量有直接的關(guān)系，而SEC/GPCt分離不同尺寸及分子量的分子，結(jié)合此兩種特性，可以得到許多有用的信息，并廣泛地應(yīng)用于高分子，生化及動(dòng)力學(xué)

14、等研究領(lǐng)域。圖11三個(gè)檢測(cè)角度0scatteringangle、圖10雜質(zhì)較多的GPC層析圖SolventSolventGlassCellGlassCell6rObservedangle圖12十八角度檢測(cè)器1高分子聚合物特性(Multi-AngleLaserLightScattering_MALLS合SEC/GPC不必依賴泵的流速，校正曲線及其它任何的假設(shè)，即可直接求得重均絕對(duì)MALLSPJ用色譜柱分離出的樣品在各個(gè)角度的光散射量（如圖13）,由RI檢測(cè)器得到的洗脫液濃度及dn/dc值，即可計(jì)算出各個(gè)切片的分子量。MALLSW得絕對(duì)分子量所需的各種物性均可由實(shí)驗(yàn)直接求得，無(wú)需作任何假設(shè)。而GP

15、C的色譜柱又有分離雜質(zhì)的功能，可以避免傳統(tǒng)的光散射需極小心準(zhǔn)備樣品的麻煩。圖14顯示高分子混合物經(jīng)SE3離后MALLSSRI的洗脫體積對(duì)照?qǐng)D。由此圖看出RI對(duì)大分子量濃度低的物質(zhì)較不敏感，而對(duì)低分子量高濃度者較敏感。利用多角度激光光散射系統(tǒng)分子量及分子量分布等數(shù)據(jù)。MAT1:3DPlot圖13光散射強(qiáng)度，洗脫體積與角度作圖OLD-4JO3R1MJC1OLD-4JO3R1MJC11010口VcAumeVcAume：mLmL）圖14這是由ASTR儆件得到的miniDAWN（上）和Optilab示差檢測(cè)器（下）信號(hào)。JnJnJ JMaMaStripZhinrtStripZhinrt- -RfEIRT

16、ARfEIRTA口e6-1。a口2 .蛋白質(zhì)及其聚合體在各種工業(yè)應(yīng)用中，決定蛋白質(zhì)的絕對(duì)特性不僅嚴(yán)格而且必要，例如在生化工程應(yīng)用上，以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的產(chǎn)品必須很純而且無(wú)任何聚集存在。而測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量和是否有聚集態(tài)存在，光散射法是最理想的工具之一。以往， 在水相中用低角度光散射測(cè)量法 （LALLS受到溶劑中不純的物質(zhì)干擾相當(dāng)大。 而MALLS的多角度測(cè)量大大降低了背景噪音的干擾，并能提供完整的信息和良好的重現(xiàn)性結(jié)果。圖16顯示蛋白質(zhì)混合物的MALLS和RI的信號(hào)。樣品在0.1MNaCl中含0.05M的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行RI為WyattOptilab903,流速為0.1mL/min,色譜柱為Sh

17、odexKW-803和KW-804雖然此樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣品，但MALLS5很清楚地檢測(cè)到聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象在RI幾乎無(wú)法辨認(rèn)。3 .分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影響其物理和化學(xué)性質(zhì)的一個(gè)重要因素。采用多角度激光光散射系統(tǒng)（MALLS與GPC/SEC（統(tǒng)聯(lián)用是唯一決定分枝系數(shù)gM的方法。IOM-1IOM-1O1 1OMIQOMIQ&,O10.012.0圖15分子量對(duì)洗脫體積圖，有四個(gè)明顯的峰1BSA67,00064,3007001%23緩激肽1,0601,090+102%4溶解酵素14,30014,600+3001%亮氨酸腦啡肽556592+63%C口口r111KMMnqq-J一1-11

18、雖然也有其他確定分枝的方法，但都不能直接且需要眾多假設(shè)及“虛擬因子”。由傳統(tǒng)的RI或Viscometer（粘度檢測(cè)器）測(cè)定的高枝化分子的分子量與絕對(duì)值有很大的差別，若欲做有效的色譜柱校正，則需以一系列與待測(cè)物成分相同的標(biāo)準(zhǔn)品作校正。若標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)物的成分或組分不同，則會(huì)產(chǎn)生很大的誤差。例如分子量相同的球形高分子的洗脫時(shí)間比無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀分子要長(zhǎng)。因?yàn)镸ALL斫求得分子量和大小為絕對(duì)值， 因此計(jì)算分枝系數(shù)gM不需要任何假設(shè),由MALLSft接所求得的分子大小會(huì)直接影響分枝率。對(duì)分子量相同的長(zhǎng)鏈狀分子而言，其值越小，則分枝程度越大。分枝比的定義為分枝分子的旋轉(zhuǎn)半徑與長(zhǎng)鏈分子的旋轉(zhuǎn)半徑之比，即gM=

19、b/i由MALLSW得。圖17為由MALLSM得的分枝狀和長(zhǎng)鏈形的高分子（PS）的旋轉(zhuǎn)半徑和分子量對(duì)照?qǐng)D。由圖中可看出，雖然其分子量相同，但分布明顯不同。圖18為rg對(duì)Mw做圖。1x1O1x1OT T1x1O1x1O5 51x1Q1x1Qs sMotecularWejghtMotecularWejght圖17PS線形與枝化分子的對(duì)照?qǐng)D圖18旋轉(zhuǎn)半徑對(duì)分子量圖（分子構(gòu)型圖），可以看出樣品（藻酸鈉）在輻射后分子構(gòu)型的變化。6 .動(dòng)力學(xué)/反應(yīng)速率MALLS5可以用于如抗原，抗體等反應(yīng)迅速的溶液系統(tǒng)，粒子和蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象的檢測(cè)。因?yàn)镸ALLS內(nèi)部同時(shí)裝有數(shù)個(gè)固定的檢測(cè)器，所以不需移動(dòng)任何儀器硬件來(lái)掃描

20、樣品，即可及時(shí)多方位同時(shí)捕捉反應(yīng)速率的現(xiàn)象。使用MALLS可研究抗原-抗體反應(yīng)，反應(yīng)發(fā)生時(shí)就可決定聚集粒子的大小。當(dāng)改變溫度，濃度或催化劑時(shí)，MALLST記錄下反應(yīng)發(fā)生時(shí)，分子的特殊變化。圖19濃度變化對(duì)蛋白聚集的影響使用DAWN僉測(cè)器研究了濃度對(duì)分子量為75KD單分子蛋白質(zhì)聚集作用的影響。 圖19描述了這種特殊蛋白質(zhì)從30ug/ml至U1mg/ml范圍內(nèi)得到的濃度相關(guān)性。如圖所示，該蛋白質(zhì)在低濃度作為單一分子而在濃度大于700ug/ml時(shí)聚集為六聚體。該結(jié)果與由gluteraldehyde高度交聯(lián)技術(shù)所得結(jié)合完全相符。ProteinMassvs.ConcentrationO0.20.4oe0.81O0.20.4oe0.81ConcentrationConcentration（ing/mLing/mL圖20溫度變化對(duì)PMM份子量和大小的影響7.低分子量的測(cè)定DAW陽(yáng)ELEO或miniDAWTREOS勺固定光電二極管檢測(cè)器可以捕捉到很微弱的光散射信號(hào)，使得分子量的測(cè)定成為可能。使用DAW陳列標(biāo)準(zhǔn)配制的任何一款激光器，都可以輕易地測(cè)量分子量低于2000D的聚合物，并具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。由于DAWN