4第四章 基因克隆的載體-4噬菌粒載體

1、第四節(jié)第四節(jié) 噬菌粒載體噬菌粒載體噬菌粒載體噬菌粒載體 由由質(zhì)粒質(zhì)粒載體和載體和單鏈?zhǔn)删w單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的載體結(jié)合而成的新型的載體系列。新型的載體系列。 DNA長(zhǎng)約長(zhǎng)約3 kb，可攜帶約，可攜帶約10 kb的外源的外源基因。基因。 它具有它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便多克隆位點(diǎn)等，方便DNADNA的操作，可在細(xì)胞的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在在輔助噬菌體輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。常用的

2、噬菌粒載體常用的噬菌粒載體pUC118pUC118和和pUC119pUC119是一對(duì)分別由是一對(duì)分別由pUC18pUC18和和pUC19pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒與野生型與野生型M13M13噬菌體噬菌體的的基因間隔區(qū)（基因間隔區(qū)（IGIG）重組而成的噬菌粒載體。）重組而成的噬菌粒載體。 1. 1. 具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組DNADNA，可克隆可克隆10kb10kb的外源的外源DNADNA片段，并片段，并易于進(jìn)行分離易于進(jìn)行分離與操作；與操作； 2. 2. 編碼一個(gè)編碼一個(gè)ampampr r基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜

3、帶pUC118pUC118或或pUC119pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子便于轉(zhuǎn)化子的選擇的選擇； 3. 3. 拷貝數(shù)含量高拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá)，每個(gè)寄主可高達(dá)500500個(gè)，所以只要用個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNADNA； 4. 4. 存在著一個(gè)存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類型的外區(qū)，因此許多種不同類型的外源源DNADNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分

4、子上；片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上； 5. 5. 由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌lacZlacZ基因基因的的5-5-端編碼區(qū)，可按照端編碼區(qū)，可按照IPTGIPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子；試驗(yàn)，篩選重組子；6. lacZ6. lacZ基因是置于基因是置于laclac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；的形式表達(dá)；7. 7. 含有含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒(méi)有輔助噬菌體的情，在沒(méi)有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)況下，克

5、隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，的方式，復(fù)制復(fù)制形成大量的雙鏈形成大量的雙鏈DNADNA分子分子8. 8. 帶有一個(gè)帶有一個(gè)M13M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單鏈成出單鏈DNADNA拷貝，并包裝成噬菌體顆拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；分泌到培養(yǎng)基中； 9. 9. 在在pUC118pUC118和和pUC119pUC119這兩個(gè)載體中，多這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基

6、因的基因的正鏈正鏈DNADNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)負(fù)鏈鏈DNADNA；10. 10. 可以直接對(duì)克隆的可以直接對(duì)克隆的DNADNA片斷進(jìn)行核苷片斷進(jìn)行核苷酸的酸的序列測(cè)定序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。pBluescriptpBluescript噬菌粒載體噬菌粒載體基本結(jié)構(gòu)：基本結(jié)構(gòu)： 1. 1. 在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì)在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì)T3T3和和T7T7噬菌體噬菌體的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)； 2. 2. 同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删w同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删wM13M13或或f1 f1的復(fù)制起的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的成單鏈或雙鏈的DNADNA； 3. 3. 編碼有一個(gè)胺芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化編碼有一個(gè)胺芐青霉素抗性基因