海參多糖的分離純化方法及其主要生理作用.

1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生課程論文論文題目海參多糖的分離純化方法及其主要生理作用學(xué)生專(zhuān)業(yè)班級(jí)應(yīng)用化學(xué) 2009 級(jí) 1 班學(xué)生姓名（學(xué)號(hào)）XXXXXXXXX）指 導(dǎo) 教 師 XXXXXX完成時(shí)間2011年11月11日2011年 11 月 11日海參多糖的分離純化方法及其主要生理作用摘要：海參（ sea cucumbers ）是民間珍貴的藥膳食品，海參體壁中含有的多糖成分具有抗腫瘤、抗血凝、抗放射、增強(qiáng)免疫力等多種生理功能。本文介紹了海參多糖的提取、分離、純化級(jí)純度鑒定方面的相關(guān)技術(shù)，闡述了海參多糖生物活性及開(kāi)發(fā)途徑，并提出其研發(fā)方向。關(guān)鍵詞 ：海參多糖；分離純化方法；生物活性一、海參多糖的分離提取與純

2、化海參多糖具有良好的保健功能，許多海參多糖的產(chǎn)品已作為保健食品進(jìn)行開(kāi)發(fā)。以刺參為原料研制的海參口服液，認(rèn)為其對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的作用顯著。目前，海參多糖主要應(yīng)用于保健品或化妝品 J ，很少開(kāi)發(fā)成藥物，主要原因是海參多糖分離純化技術(shù)難度大。多糖是親水性大分子物質(zhì)，它的分離純化方法有別于小分子物質(zhì)，而且不同的多糖具有不同性質(zhì)，必須采用不同的分離純化方法。1 海參多糖的分離提取方法多糖是極性大分子化合物，通常破碎后的原料常用水做溶劑來(lái)提取粗多糖，但海參多糖是含有糖胺聚糖的酸性粘多糖在熱水中溶解度不大，通常采用堿提取法和酶解法。（ 1） 堿提取法一般使用稀 NaOH溶液或 KOH溶液進(jìn)行提取，此

3、法可以從組織中對(duì)海參多糖進(jìn)行較完全的提取，但多糖分子有可能被堿進(jìn)一步降解，因此在提取時(shí)所采用堿的濃度、堿解溫度和時(shí)間都應(yīng)優(yōu)化篩選。通常使用的稀堿溶液的濃度在 5 一 10之間，溫度保持在 10以下，否則多糖容易發(fā)生降解反應(yīng)。（2） 酶解法糖胺聚糖是通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白聚糖的核心蛋白相接，并通過(guò)靜電作用或立體化學(xué)效應(yīng)和其他蛋白質(zhì)發(fā)生專(zhuān)一性程度不一的結(jié)合，在制備 GAG時(shí)常用降解蛋白的手段使與之結(jié)合的 GAG鍵得以釋放 J 。蛋白酶解法是目前 GAG提取過(guò)程中使蛋白質(zhì)與聚糖分離最為廣泛應(yīng)用的方法，酶解后用沉淀法可獲得海參粗多糖。蛋白酶解法在蛋白酶消化組織時(shí)，一般選用對(duì)肽鍵斷裂作用專(zhuān)一性低的、譜廣的微生

4、物酶和植物酶為宜。例如選擇鏈霉蛋白酶 (pronase 、堿性蛋白酶 (nagarase 或 subtilisin 和木瓜蛋白酶等以達(dá)到最大水解效果，動(dòng)物性蛋白酶如胰蛋白酶的使用也較為普遍。較酶法提取的多糖蛋白含量低，由于堿作用廣泛，并且作用強(qiáng)，能夠裂解肽鏈和糖鏈，但是堿液作用強(qiáng)，很可能引起糖基的脫落和結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)組織的蛋白降解不如酶解作用有效，酶作用相對(duì)溫和，用酶解法能夠保護(hù)糖鏈和部分肽鏈，保持多糖分子的完整性。因此，可采用堿提取法結(jié)合酶解法提取海參多糖，可以更有效的降低多糖中的蛋白質(zhì)的含量，同時(shí)保持多糖分子的完整性和其生物活性。2 海參多糖的純化海參多糖經(jīng)去色素、去蛋白等雜質(zhì)后，為了能更

5、好的探討海參多糖的性質(zhì)，還有必要對(duì)其做進(jìn)一步的純化。目前，多糖的分離純化方法主要有分級(jí)沉淀法、鹽析法、金屬絡(luò)合法、有機(jī)鹽沉淀法、季胺鹽沉淀法和柱層析法等。海參多糖的純化一般是采用柱層析法，此法效果好且操作簡(jiǎn)單。（1）纖維素柱層析纖維素層析柱用纖維素填充，柱內(nèi)纖維素用乙醇平衡好，將多糖混合物全部沉淀于隋性多孔的纖維素柱上面，然后用不同濃度乙醇水溶液洗脫，使不同的多糖就依次洗脫出來(lái)。在洗脫過(guò)程中，各種多糖在柱上進(jìn)行無(wú)數(shù)次的溶解和沉淀過(guò)程，最終將各種多糖分離出來(lái)。這種方法實(shí)質(zhì)上與分級(jí)沉淀法相反，可稱(chēng)為“分級(jí)溶解法”，其理論塔板數(shù)較高，所以流出液的純度較高。該法的缺點(diǎn)是流速慢，純化周期長(zhǎng)，不大適應(yīng)粘度

6、大的酸性多糖的分離純化。（2）陰離子交換柱層析陰離子交換柱層析 l3_ 是目前多糖純化中最常用的一種方法。它適合于分離各種酸性、中性多糖及粘多糖。它的分離機(jī)理不是單一的離子交換，而更重要的是吸附與解吸附，所以其不僅可應(yīng)用于中性多糖與酸性多糖的分離，也可應(yīng)用于不同中性多糖的分離。一般在pH值為 6 時(shí)，酸性多糖能吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，然后用pH值相同、離子強(qiáng)度不同的緩沖液將酸多糖分別洗脫下來(lái)，如果柱為堿性 ( 即 OH一型，則中性多糖也能吸附。目前應(yīng)用最廣泛的陰離子交換劑有二乙基氨基乙基纖維素 (DEAE cellulose，DEAE一葡聚糖 (DEAE Sephadex及 DEAE一

7、瓊脂糖 (DEAESepharose 三種。陳健等 _1 糾在研究分離糙海參酸性粘多糖中，把粗多糖經(jīng) DEAE Sepharose F F柱層析進(jìn)行分級(jí)純化，以05molL 的NaC1為洗脫劑，按 5mL體積分部收集，以硫酸一苯酚比色法測(cè)定多糖的含量，合并多糖出峰部分，真空冷凍干燥即得糙海參多糖的白色純品。DEAE SepharoseFF是新近使用陰離子交換劑，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，流速快，較上述三種交換劑使用更廣泛。二、生理活性1、抗腫瘤作用近年來(lái)，有關(guān)海參酸性粘多糖抗腫瘤的研究取得了積極進(jìn)展。吳萍茹等用兩種方法從二色桌片參鮮品中提取多糖，提取物分別為糖蛋白I 和含糖量較高的糖蛋白，該兩種多糖為含

8、有巖藻糖和巖藻糖硫酸酯的直鏈均一多糖，不含有其它糖基。藥理活性研表明，糖蛋白明顯抑制小鼠 S180 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而糖蛋白 I 的抑制作用不明顯，且可增加荷瘤小鼠脾臟重量，但糖蛋白無(wú)此作用，推測(cè)糖蛋白抑瘤作用顯著。通常情況下，多糖具有抗衰老作用與提高免疫功能、清除體內(nèi)氧自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化密切相關(guān)。一般認(rèn)為氧自由基的增多是導(dǎo)致機(jī)體衰老的主要原因，而超氧物歧化酶 (SOD通過(guò)清除氧自由基起到延緩衰老作用。藥理研究表明花刺參多糖提取物能顯著提高小鼠紅細(xì)胞 SOD活性，具有延緩衰老作用 J 。龔燕波，方崇波等 在海地瓜多糖的抗衰老生物活性研究中，用海地瓜多糖按生藥量喂養(yǎng)小白鼠與對(duì)照組用生理鹽水喂養(yǎng)

9、對(duì)比，進(jìn)行耐缺氧實(shí)驗(yàn)、游泳實(shí)驗(yàn)及耐高溫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用多糖喂養(yǎng)的小白鼠存活時(shí)間均長(zhǎng)于對(duì)照組，表明海地瓜多糖能延長(zhǎng)小白鼠生存時(shí)間，3、增強(qiáng)免疫力海參多糖也能提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，可改善使用抗癌藥物引起的機(jī)體免疫功能低下?tīng)顩r。有資料表明，刺參酸性粘多糖能使人的白細(xì)胞懸浮物中的E 花環(huán)數(shù)量增加， EAC花環(huán)和 SmIg 的表達(dá)，因此誰(shuí)知它有增強(qiáng)細(xì)胞免疫作用?？赡苁且?yàn)樗饔糜跓o(wú)活性細(xì)胞亞群，致使活性的T 細(xì)胞增加入抑制細(xì)胞數(shù)量也就增加，從而抑制了 B 細(xì)胞活化和 SmIg表達(dá)。玉足海參多糖能明顯增加小鼠免疫器官脾臟的重量，促進(jìn)機(jī)體對(duì)血中碳粒的吞噬速度，明顯提高機(jī)體單核一巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能，是一種作

10、用較強(qiáng)的免疫促進(jìn)劑，可用于腫瘤病人的輔助治療。二色桌片參經(jīng)雙酶水解、乙醇沉淀等步驟從干參體內(nèi)分離得到均一多糖純品pmi-1。經(jīng)化學(xué)反應(yīng)測(cè)定和波譜數(shù)據(jù)分析，確定pmi-1 是一種由 L- 巖藻糖基和 L- 巖藻糖基 -4- 硫酸酯構(gòu)成的直鏈均一多糖。它能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，顯著增加脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生 IL-2 的水平，增強(qiáng)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)（ DTH），增加脾、胸腺指數(shù)，增強(qiáng)細(xì)胞免疫，具有較強(qiáng)免疫活性。4、抗凝血作用我國(guó)學(xué)者樊繪曾采用酶水解、乙醇沉淀、氧化脫色、二乙氨乙基纖維素分離等方法，從刺參體壁中提取得到刺參多糖得主要有效成分刺參酸性粘多糖(stichopus japonicus acidi

11、c mucopoly-sacccharide，簡(jiǎn)稱(chēng) Sjamp）。國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究表明海參中酸性粘多糖基本上由氨基己糖、己糖醛酸、巖藻糖及硫酸基組成，四者的分子比是1:1:1:4，平均分子量為55000。也有測(cè)得相對(duì)分子量為50000。早期報(bào)道表明刺參提取液有抗凝血作用，但刺參體壁酸性粘多糖在體外有明顯的抑制血小板解聚作用，由于它使血小板聚集性增高，產(chǎn)生血小板自發(fā)性聚集，在血循環(huán)中的血小板聚集體不能通過(guò)臟器和組織中的毛細(xì)血管而被扣下出現(xiàn)血小板減少。藥理研究表明，家兔注射 Sjamp 后，血循環(huán)小血小板 量明顯減少，而血小板數(shù)量減少是由于 Sjamp 使血小板聚集性增高，導(dǎo)致血小板聚集體增多所致。

12、由于血小板的粘附聚集在早期凝血過(guò)程中的重要作用，所以血循環(huán)中血小板數(shù)量的 量消耗造成動(dòng)物早期凝血功能異常。 Sjamp 對(duì)血小板的凝集作用并不引起血小板的活化和代謝，也入發(fā)生形態(tài)上的變化， 種凝集作用使血小板小能發(fā)揮應(yīng)有的生理活性和功能，從而達(dá)到抗凝血和抗血栓的目的。綜上所述，海參中所含有效成分 - 粘多糖、蛋白多糖，具有多方面的生物活性，在醫(yī)學(xué)中有廣泛的應(yīng)用前景。隨著研究的逐步深入，海參很有可能成為開(kāi)發(fā)新型藥物的資源。三、結(jié)語(yǔ)我國(guó)有 20 余種的海參可供使用，過(guò)去人們直接將其應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等方面。而近 40 年來(lái)，人們逐漸轉(zhuǎn)向從藥效成分、醫(yī)學(xué)及保健作用方面進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)海參含有多糖、多肽及皂苷等多種活性物質(zhì)，表明多糖的分離和純化十分復(fù)雜，要得到均一的活性多糖組分并不容易。海參多糖的分離純化方法很多，可以根據(jù)不同品種海參的多糖性質(zhì)選擇正確的分離純化方法，已得到組分純的多糖。隨著人們對(duì)海參生物活性物質(zhì)及其作用研究的不斷重視和深入，海參多糖已成為海洋藥物及保健品研發(fā)中的重要物質(zhì)，此外，海參多糖因其聚陰離子與水具有較強(qiáng)的親和力，具有優(yōu)良的保健功能，可作為化妝品的天然營(yíng)養(yǎng)添加劑，在美容方面的利用也成為研究發(fā)展的重要方向。參考文獻(xiàn)1 廖玉麟中國(guó)動(dòng)物志棘皮動(dòng)物門(mén)海參綱M 北京：科學(xué)出版社， 19972 王洪濤，付學(xué)軍，等海參多肽、多糖綜合提取工藝條