活細胞鈣離子濃度熒光顯微檢測系統(tǒng)的研制和應(yīng)用

1、生物醫(yī)學(xué)工程研究JournalofBiomedicalEngineeringResearch活細胞鈣離子濃度熒光顯微檢測系統(tǒng)的研制和應(yīng)用蘭李,周云燕,楊志勇,瞿安連,徐濤(華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物物理與化學(xué)研究所,湖北武漢430074)摘要:研制了活細胞鈣離子濃度熒光顯微檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)的工作原理是:氙燈發(fā)射的光線被橢球面鏡聚焦后以衍射光柵分光,通過光纖、雙路耦合聚光鏡和物鏡將單色光纖入樣本平面以激發(fā)細胞中的鈣離子熒光探針發(fā)出熒光,最后用光電倍增管檢測熒光信號。使用該系統(tǒng),測定了高K+去極化刺激下PC12細胞(大鼠嗜鉻細胞瘤細胞)內(nèi)Ca2+i變化的動態(tài)特性曲線。結(jié)果表明:靜息狀態(tài)下P

2、C12細胞內(nèi)Ca2+i為80.0±15.0nmol/L,高K+去極化刺激可使PC12細胞內(nèi)Ca2+i增加到1.9±0.2mol/L,上升至峰值時間約為20.1s。表明此系統(tǒng)可以滿足檢測活體細胞Ca2+i的需要。關(guān)鍵詞:熒光顯微鏡;胞內(nèi)鈣離子濃度;橢球面鏡;雙路耦合聚光鏡;PC12細胞;高鉀去極化中圖分類號:Q-336;R318文獻標(biāo)識碼:A文章編號:167226278(2004)0220114204DevelopmentandApplicationoftheFluorescentMicroscopySystemforDetectingCa2+iinLivingCellsLA

3、NLi,ZHOUYun-yan,YANGZhi-yong,QUAn-lian,XUTao(InstituteofBiophysicsandBiochemistry,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074China)Abstract:ThefluorescentmicroscopysystemtodetectCa2+iinlivingcellswasbuild.Inthissystem,thelightfromthexenonlightsourcewasconvergedbyellipticalmirroranddiffracte

4、dbydiffractiongrating;thentheopticalfiberanddual-couplingcondensortransmittedmonochromaticlighttothespecimenplanetogeneratethefluorescenceofthefluorescentprobewithinthecell;atlastthefluorescentsignalwas2+detectedbythephotomultipliertube.Usingthissystem,thedynamiccurveofCaiinPC12cellsafterhighK+depol

5、arizationwasgiven.TheresultsshowedthattherestinglevelsofCa2+iinPC12cellswere80.0±15.0nmol/L.AfterhighK+depolarizationwasgiven,thecon2centrationsofintracellularfreeCa2+iinPC12cellswereraisedby1.9±0.2mol/L,andthetimeofhigh-K+depolarizationstimulating2+Ca2+ielevationtoapeakpointwasabout20.1s.

6、TheseresultsverifythatthissystemissuitablefordetectingCaiinlivingcells.Keywords:Fluorescentmicroscope;IntracellularCa2+concentration(Ca2+i);Ellipticalmirror;Dual-couplingcondensor;PC12cells;HighK+depolarization采用鈣離子熒光探針對細胞內(nèi)鈣離子等信使物質(zhì)進行定量測定是研究細胞分泌活動的重要技術(shù)手段。其基本原理是:用熒光探針標(biāo)記樣本中的鈣離子,根據(jù)樣本中的熒光探針特性單色光源發(fā)出單色光,誘發(fā)

7、出熒光。然后根據(jù)傳感器檢測到的熒光特性即可分析樣本中的鈣離子濃度1。在目前的生理學(xué)研究中,僅測量細胞中的靜息鈣離子濃度是不夠的,通常需要在監(jiān)測過程中改變鈣離子濃度以定量研究各因素對分泌的影響。Ca2+螯合物DM-nitro2基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30327001)phen和NitrophenylEGTA可用于快速且均勻的提升細胞內(nèi)鈣離子的濃度,將此物質(zhì)與Ca2+染料通過膜片鉗電極或孵育的方法導(dǎo)入細胞內(nèi),然后經(jīng)過高能量的紫外光激發(fā),使Ca2+螯合物瞬時分解,鈣迅速且均勻升高。這種技術(shù)稱為鈣離子光解釋放技術(shù)?，F(xiàn)代生理學(xué)研究中,鈣離子熒光標(biāo)記檢測技術(shù)與光解釋放技術(shù)常結(jié)合使用。我們研制的

8、以熒光標(biāo)記法為基礎(chǔ)的活細胞鈣離子濃度檢測系統(tǒng)(下稱為熒光測鈣系統(tǒng))即基于上述原理,在提供對胞內(nèi)鈣離子定;國家自然科學(xué)基金資助重點項目(30130230)。作者簡介:蘭李(1979-),男,華中科技大學(xué)碩士研究生。© 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.第2期蘭李,等1活細胞鈣離子濃度熒光顯微檢測系統(tǒng)的研制和應(yīng)用115量檢測手段的同時,兼顧光解釋放實驗的需要。1儀器設(shè)計熒光測鈣系統(tǒng)可分為單色光源、熒光顯微鏡、熒光采集系統(tǒng)(包括光電倍增管、CCD和監(jiān)視器)3個主要部分,見圖1。由于需

9、要同時引入光解釋放激發(fā)光,故設(shè)計了雙路耦合聚光鏡以引入兩路光。此系統(tǒng)中單色光源提供單色激發(fā)光,隨后光纖與雙路耦合聚光鏡將激發(fā)光引入熒光顯微鏡;熒光顯微鏡將激發(fā)光聚焦于樣本平面以誘發(fā)熒光;熒光采集系統(tǒng)采集并記錄熒光信號。計算機控制單色光波長的切換、熒光信號的采集以及實驗數(shù)據(jù)的初步處理。困難,此方案還是可取的。按此方案構(gòu)建單色光源的輸出功率-波長曲線(光譜輸出),見圖3,曲線中橫坐標(biāo)為波長,縱坐標(biāo)為對應(yīng)的輸出光功率。圖3中帶有標(biāo)記1的為德國TILLPhotonicsGmbH的Poly2chrome-在相應(yīng)波長的光功率輸出,標(biāo)記2為同一家公司的Polychrome-在相應(yīng)波長的光功率輸出。Polyc

10、hrome-IV采用150W氙燈,Polychrome-I與本單色光源采用75W氙燈。由此可見,本光源的輸出功率基本與TILLPhotonicsGmbH的同類產(chǎn)品相當(dāng),而且在可見光譜段輸出穩(wěn)定,表明此光源不僅可以滿足熒光測鈣的需要,而且可滿足諸如綠色熒光蛋白檢測、FM染料檢測等多種不同實驗的要求。圖1熒光測鈣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig1StructureofthefluorescencemicroscopysystemfordetectingCa2+i圖3單色光源光譜輸出(采用CoherentAuburnGroup公司(USA)出品的Field2masterGS型光功率計測量)Fig3Spectralou

11、tputofmonochromator(measuredbythepoweranalyzerFieldmasterGS,CoherentAuburnGroup,USA)我們的工作主要集中在單色光源、雙路耦合聚光鏡與熒光采集系統(tǒng)的研制上。按系統(tǒng)的運行順序?qū)Ω鞑糠值男路f性作出說明。1.1基于橢球面鏡的單色光源見圖2。1.2簡潔實用的雙路光纖耦合鏡圖2單色光源光路原理圖Fig2Schematicdiagramofmonochromator本研究的主要工作原理是將氙燈光源發(fā)出的光線聚焦后準直,再由光柵分解為單色光。其關(guān)鍵部件為氙燈的聚光鏡。國外同類產(chǎn)品采用的是難以加工的環(huán)面鏡,不適合本單色光源使用,因

12、此,我們使用易加工的橢球面鏡作為系統(tǒng)的聚光鏡。通過軟件模擬,相同條件下橢球鏡的實際可用匯聚能量是環(huán)面鏡的1.8倍。即使橢球鏡的安裝與調(diào)試比環(huán)面鏡雙路耦合聚光鏡主要功能為:(1)將光纖出射的單色光與光解激發(fā)光按顯微鏡物鏡參數(shù)準直后引入顯微鏡;(2)將單色光與光解激發(fā)光按一定比例進行配比輸出。為實現(xiàn)功能1,設(shè)計了優(yōu)化的四片式光學(xué)結(jié)構(gòu),進行了精細的像差矯正、采用了針對所用波長的增透膜并構(gòu)建了一體化的機械支架,從而保證樣本平面上獲得了足夠且均勻的照明。為實現(xiàn)功能2,采用二色分光鏡實現(xiàn)兩路光源的特定配比輸出。1.3高靈敏度、高信噪比的檢測機構(gòu)由于鈣離子實驗中的輸出的熒光信號既微弱且信噪比較低,故使用HA

13、MAMATSUPhotonicsKK公司的高靈敏度H5784-2型光電倍增管作為檢測器,同時在檢測器外圍設(shè)計了增益電路與低通貝賽爾濾波電路,以提高輸出信號的品質(zhì)。2實驗部分利用所開發(fā)的熒光測鈣系統(tǒng),研究了高K+刺激對PC12細胞(大鼠嗜鉻細胞瘤細胞)內(nèi)游離鈣離© 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.生物醫(yī)學(xué)工程研究第23卷116子濃度的影響。2.1試劑與溶液HEPES,Glucose及其它常用試劑均系Sigma公司產(chǎn)。Frua-2/AM為MolecularProbe產(chǎn)品。2.1.

14、1標(biāo)準細胞外液NaCl135mmol/L,KCl2mmol/L,MgCl2.6H2O2mmol/L,HEPES10mmol/L,Glucose4g/L,CaCl2.2H2O5mmol/LpH=7.2滲透2.5結(jié)果與討論2.5.1胞內(nèi)游離Ca2+i計算采用雙波長熒光測鈣法測量PC12細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。即將胞內(nèi)熒光探針在不同激發(fā)波長(340nm、380nm)發(fā)射的熒光強度值,代入以下公式求出Ca2+i3:Ca2+i=Keff(RR)(Rmax-R)壓310mmol/L2.1.2高K+刺激液NaCl77mmol/L,KCl60mmol/L,MgCl2.6H2O2mmol/L,HEPES10mmo

15、l/L,Glucose4g/L,CaCl2.2H2O5mmol/LpH=7.2滲透壓295mmol/L2.1.3Fura-2/AM熒光試劑的配制(1)助溶母液(Pluronicstock)1gPluronicF-127+5mlDMSO(20%W/V);(2)Fura-2/AM母液50gFura-2/AM+50lPluronicstock+10ml細胞外液(-20保存);(3)最終溶液250lFura-2/AM母液+0.5ml其中R為兩種激發(fā)波長下熒光強度的比值,即R=F(340)/F(380),為排除背景光的干擾,可減去背景光強度,即R=F(340)-F(280)/F(380)-F(280);

16、Rmin與Rmax分別對應(yīng)鈣離子濃度最小(零鈣)和最大(10mmol/L)時的R值,Keff為有效結(jié)合常數(shù)。2.5.2高K+去極化刺激對胞內(nèi)Ca2+i的影響本實細胞外液。2.2儀器與設(shè)備自制熒光單色激發(fā)光源、顯微鏡(AxiovertS100TV,ZEISS;Germany)、物鏡(UplanApo,100×/1.35OillrisOlympus;Japan)、光纖(=1.25mm,NA=0.25)、自制熒光信號檢測裝置、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(EPC9,HEKAElektronikGmbH;Germany)、數(shù)據(jù)采集及光源控制軟件(Pulse,HEKAElektronikGmbH;Ger2ma

17、ny)、數(shù)據(jù)處理軟件(IgorPro4.03)。2.3PC12細胞培養(yǎng)2驗觀察了高濃度的K+溶液對PC12細胞內(nèi)Ca2+i的影響。實驗中每個細胞采樣400次,一次采樣時間55ms,其中激發(fā)光波長340nm下激發(fā)時間為15ms,380nm下15ms,其余時間保持激發(fā)光波長為靜息波長(280nm),采樣頻率10kHz。其中一次測量結(jié)果見圖4:前135s內(nèi),測定細胞靜息狀態(tài)下游離鈣離子濃度,開始階段由于進行了光照與清洗,細胞處于適應(yīng)期,故存在一定的鈣振蕩,測得的Ca2+i為60120nmol/L,均值約為80nmol/L。由文獻4得知,正常細胞內(nèi)Ca2+i為50150nmol/L,可見本系統(tǒng)測量結(jié)果

18、基本準確。經(jīng)歷約90s后測量值穩(wěn)定在80nmol/L左右,持續(xù)至加入高K+刺激液方才改變,證明系統(tǒng)輸出特性相當(dāng)穩(wěn)定。加入高K+刺激液后,Ca2+i經(jīng)歷短期振蕩,迅速升高接近2mol/L。停止加藥后,局部高K+迅速擴散,因此Ca2+i隨之下降到約200nmol/L,隨后在這一水平附近震蕩。本實驗測量了58個細胞。其結(jié)果是,靜息狀態(tài)下PC12細胞內(nèi)Ca2+i為80.0±15.0nmol/L,高K+去極化刺激可使PC12細胞內(nèi)Ca2+i增加到1.9±0.mol/L,上升至峰值時間約為20.1s。上述結(jié)果與國外2文獻中使用TILLPhotonicsGmbH的同類產(chǎn)品所得出的結(jié)論完全

19、一致5,6。證明了本系統(tǒng)可以滿足生理學(xué)研究中檢測活體細胞Ca2+i的需要。復(fù)蘇后的PC12細胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37、5%CO2)。隔日更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)液的成分為:CMEM85%,馬血清10%,胎牛血清5%,pH7.27.4。待細胞鋪滿瓶底,用0.25%胰蛋白酶消化,消化完全后加入DMEM+10%小牛血清終止消化,用吸管吹打均勻,接種入培養(yǎng)板(內(nèi)含預(yù)先用0.1%多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)處理的載玻片)中。培養(yǎng)24h后用于測定細胞內(nèi)鈣離子濃度。2.4細胞內(nèi)游離Ca2+i測定過程貼壁培養(yǎng)的細胞載玻片用細胞外液清洗兩次后,浸泡在Fura-2/AM負載溶液中

20、37避光培育20min,讓熒光染料充分進入細胞。隨后取出載玻片再用細胞外液洗2次,在熒光測鈣系統(tǒng)上測定單個細胞的熒光強度。激發(fā)波長為340nm和380nm,發(fā)射波長為505nm。在一定時刻內(nèi)用微量進樣器小心加入高K+刺激液,觀察它對所測細胞內(nèi)熒光強度的影響。圖4高K+去極化刺激引起Ca2+i的快速升高,Ca2+i使用Ca2+探針Fura-2/AM測量Fig4HighK+depolarizationgeneratingrampCa2+iincreases,measuredCa2+ibyusingaCa2+in2dicator,Fura-2/AM© 1995-2007 Tsinghua

21、Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.第2期蘭李,等1活細胞鈣離子濃度熒光顯微檢測系統(tǒng)的研制和應(yīng)用1173結(jié)論Ca2+作為細胞內(nèi)重要的信使物質(zhì),調(diào)控細胞內(nèi)許多重要的生理過程。因此,Ca2+在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用一直是細胞生物學(xué)和生物物理學(xué)研究的重點7。近20年來,細胞內(nèi)Ca2+的熒光測定法得到了快速發(fā)展?；诒嚷薀晒夥ǖ幕罴毎}離子熒光顯微檢測系統(tǒng)的研制成功,為細胞內(nèi)Ca2+i的監(jiān)測提供了新的手段。此系統(tǒng)可以連續(xù)輸出波長均勻的單色光,故可適應(yīng)未來各種新型Ca2+熒光指示劑,提供更多有關(guān)Ca2+信號的必要信息;同時此系統(tǒng)對熒光信號

22、的靈敏度高,輸出信號的信噪比高,有助于更清晰的采集、分析鈣離子探針的熒光信號。借助此系統(tǒng),可以實時、無損傷的研究細胞內(nèi)Ca2+i濃度的變化情況,有助于研究者更深入的研究和了解鈣離子在細胞內(nèi)的動態(tài)變化過程和生物調(diào)控機制,弄清各信號系統(tǒng)之間的相互關(guān)系,找出細胞內(nèi)不同類型Ca2+是否能引起不同基因表達的原因,從而幫助生物學(xué)家及生理學(xué)家總結(jié)出Ca2+作為胞內(nèi)第二信使在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的規(guī)律。參考文獻:1盧步峰,黃詒森,魯友明.用Fura雙波長熒光法測定神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣J.生物化學(xué)與生物物理進展,1994,21(3):275-277.2李海山,王金,朱衛(wèi)華,等.Fura-2探針對希土Y3+跨PC12細胞膜行為

23、研究J.無機化學(xué)學(xué)報,1999,15(1):83-88.3康華光,等.膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用M.北京:科學(xué)出版社,2003.130-138.4許鑫華,傅英松,韓波,等.熒光標(biāo)記法檢測活細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改進J.科技通報,2003,19(4):282-284.5TakuyaKishimoto,Ting-TingLiu,YasunoriNinomiya,etal.Ionse2lectivitiesoftheCa2+sensorsforexocytosisinratphaeochromocytomacellsJ.JournalofPhysiology,2001,533(3):627-637.6Tak

24、ahashiA,CamachoP,LechleiterJD,etal.Measurementofintracel2lularcalciumJ.PhysiologicalRev,1999,(79):1089.7鄒壽彬,陳良怡,康華光.胞內(nèi)鈣信號系統(tǒng)J.生命的化學(xué),2000,20(6):254-257.(收稿日期:2004-03-19)(上接107頁)化學(xué)突觸的動態(tài)特性進行了模擬,signM.PWSPublishingCompany,1996.1-422.2閻平凡,張秋水.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與模擬進化計算M.北京:清華程序結(jié)果證實了此模型的合理性,能很好再現(xiàn)突觸的易化、壓抑、增強,最后恢復(fù)到正常水平的變化過程。缺點是:對模型中各個函數(shù)的選取比較難以把握,函數(shù)選取的好壞將直接決定突觸動態(tài)特性模擬效果,對于不同的突觸應(yīng)有不同的函數(shù)表達式,同時顯現(xiàn)了模型的靈活性。本研究模型的完善還需要進一步探討,需要現(xiàn)代分子生物學(xué)對突觸的微觀解釋,如神經(jīng)遞質(zhì)在不同時刻釋放的速率,神經(jīng)遞質(zhì)的合成速率,胞內(nèi)Ca2+的高濃度性如何會導(dǎo)致物理上的變化,一般神經(jīng)終末的遞質(zhì)數(shù)量有多少,隨動作電位到來而釋放遞質(zhì)的時間數(shù)量曲線等。但