G顯帶染色體脫色FISH技術(shù)在識(shí)別胃癌標(biāo)記染色體中的應(yīng)用

1、G顯帶染色體脫色FISH技術(shù)在識(shí)別胃癌標(biāo)記染色體中的應(yīng)用【摘要】目的應(yīng)用一種能快速、準(zhǔn)確識(shí)別胃癌標(biāo)記染色體來(lái)源的技術(shù)，以提高對(duì)胃癌細(xì)胞復(fù)雜染色體畸變辨認(rèn)的能力。方法采用改良的G顯帶染色體標(biāo)本脫色后進(jìn)行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)，分別對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901的兩條標(biāo)記染色體(M1和M2)和一例原發(fā)性胃癌的標(biāo)記染色體(M3)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示了M1、M2和M3有復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)畸變：del(7)(p15)/del(7)(q22);t(1;3)(p11;q11)和del(7)(q32)。結(jié)論該方法具有信號(hào)強(qiáng)、背景低和重復(fù)性好等

2、優(yōu)點(diǎn)，在識(shí)別胃癌染色體復(fù)雜結(jié)構(gòu)改變中具有重要的作用?！娟P(guān)鍵詞】染色體畸變；細(xì)胞遺傳學(xué)；熒光原位雜交 The application of fluorescence in situ hybridization performed on the decolorized G-banding chromosomes in detecting the marker chromosomes of gastric cancerXIA Jianchuan(Department of Pathology, Cancer Center, Sun Yat-sen University of Medical Scie

3、nce, Guangzhou, Guangdong, 510060 P. R. China. E-mail: xiajc51)ZHANG Jianhua(Health Department of Jiangxi, Nanchang, Jiangxi, 330046 P. R. China)GUAN Xinyuan(Laboratory of Cancer Genetics, National Institute of Health, National Human Genome Research Institute, USA)WANG Huiyun(Laboratory of Medical G

4、enetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)LIU Quanzhang(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)ZHANG Guiyin(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. Ch

5、ina)LI Pu(Laboratory of Medical Genetics, Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150086 P. R. China)【Abstract】ObjectiveUsing a rapid, accurate method that detects the marker chromosomes of gastric cancer and enhancing the ability of discriminating complicated chromosome rearrangements of g

6、astric cancer. MethodsThe improved method of fluorescence in situ hybridization(FISH) performed on the decolorized G-banding chromosome was used. ResultsThe changes of two marker chromosomes (M1, M2) of the cell line(SGC-7901) of gastric cancer and one marker chromosomes(M3) of one primary gastric c

7、ancer were respectively analyzed by this method. The M1, M2 and M3 had complicated structural chromosome aberrations: del(7)(p15)/del(7)(q22), t(1;3)(p11;q11) and del(7)(q32). ConclusionThis method showed strong signals, low backgrounds and well-repetitions. It may play an important part in explorin

8、g the chromosome rearrangements in the process of pathogenesis and development of gastric cancer.【Key words】chromosome aberration;cytogenetics;fluorescence in situ hybridization* Project No. 39270398, supported by the National Natural Science Foundation of China熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridizat

9、ion,FISH)技術(shù)與常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，提高了人們對(duì)染色體缺失、重復(fù)、易位以及來(lái)源不清的標(biāo)記染色體的識(shí)別能力。腫瘤特征性的染色體異常，通常表明癌基因和抑癌基因的位點(diǎn)。例如：染色體缺失，常常包括抑癌基因的丟失，而染色體易位常導(dǎo)致原癌基因的激活。因此，建立一種能快速、準(zhǔn)確識(shí)別腫瘤標(biāo)記染色體的方法，對(duì)探討染色體畸變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。1材料和方法1.1標(biāo)本胃癌細(xì)胞系SGC-7901和原發(fā)性胃癌分別由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遺傳研究室和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院腹外科提供。1.2染色體涂染探針由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院，國(guó)家人類基因組研究中心，腫瘤遺傳研究室關(guān)新元博士惠贈(zèng)，探針用顯微切割獲得1。

10、1.3胃癌細(xì)胞系的染色體制備及G顯帶按常規(guī)方法復(fù)蘇胃癌細(xì)胞系，待復(fù)蘇細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)收獲，并按常規(guī)法制備染色體。一部分片子在室溫下老化23 d，置-20 備用，另一部分在75 拷片2 h后，0.025%胰酶液中處理6090 s，生理鹽水漂洗，Giemsa染色35 min；對(duì)染色體分散好、G顯帶清晰者進(jìn)行顯微照相。沖洗放大后，按ISCN(1995)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。1.4原發(fā)性胃癌染色體直接制備及G顯帶從手術(shù)剛切除的新鮮標(biāo)本上切取12 cm3的胃癌組織，置于含有RPMI-1640培養(yǎng)液(無(wú)血清)的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用眼科剪剔除非腫瘤組織及腫瘤壞死組織。將余下的腫瘤組織用37 預(yù)溫的RPMI-1640培養(yǎng)液

11、反復(fù)洗滌23次。將選取的腫瘤組織盡快剪碎。將細(xì)胞懸液及組織置于兩個(gè)離心管中，分別加入37 預(yù)溫的RPMI-1640培養(yǎng)液10 ml刻度處，加入秋水仙素，使終濃度達(dá)到1 g/ml。將標(biāo)本在37恒溫水浴箱內(nèi)培養(yǎng)11.5 h。離心(1500 r/min)8 min。去上清液，加入37 預(yù)溫的低滲液(0.4%氯化鉀0.4%枸櫞酸三鈉11)至10 ml，用吸管均勻吸打細(xì)胞，混勻，37 溫育1015 min。離心(1500r/min)8 min。去上清液，進(jìn)行第2次低滲(時(shí)間同上)。加入12 ml新鮮的固定液(甲醇冰醋酸31)，混勻后立即離心。棄上清液，加入10 ml固定液，輕輕混勻(不可用力吹打)，室溫

12、固定1520 min后離心。棄上清液，加入12 ml固定液，常規(guī)法滴片。G顯帶和染色體分析與細(xì)胞系的相同。1.5探針的生物素標(biāo)記及標(biāo)記物檢測(cè)采用缺口平移法，以biotin-14-dATP標(biāo)記探針(按GIBCO BRL公司提供的方法)。用0.8%瓊脂糖/TAE緩沖液凝膠電泳檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)物。以DNA片段長(zhǎng)度300500 bp為宜，如片段較大，則應(yīng)補(bǔ)加適量的DNase 繼續(xù)酶切，直至DNA長(zhǎng)度適中后，加5 l終止緩沖液(300 nmol/L EDTA)終止反應(yīng)。1.6熒光原位雜交1.6.1標(biāo)本的預(yù)處理將G顯帶標(biāo)本在甲醇中脫色兩次，每次5 min，75%、85%、100%酒精脫水各2 min，室溫氣干；

13、在新鮮的固定液中(甲醇冰醋酸31)固定10 min，室溫氣干；甲醛(1% formaldehyde in 1PBS/MgCl2)再固定20 min，在1PBS液中洗3次，每次5 min，酒精系列脫水各5 min，室溫氣干。1.6.2標(biāo)本變性將預(yù)處理后的標(biāo)本，置70%甲酰胺/2SSC(75)中變性23 min，立即經(jīng)70%、85%和100%的冰乙醇脫水各5 min，室溫干燥。1.6.3染色體涂染探針變性取2 l生物素標(biāo)記的涂染探針(10 g/ml)加入Cot DNA(100 g/ml)1 l，加入7 l MM2.1(5.5 ml formamide, 1 g dextran sulfate, 0

14、.5 ml 20SSC)雜交液，在76的恒溫水浴箱內(nèi)變性810 min，置37 水浴箱預(yù)復(fù)性20 min。1.6.4原位雜交將已變性或預(yù)退火的DNA探針滴于已變性并脫水的標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，rubber cement封片，放置潮濕暗盒中，在37 的恒溫箱內(nèi)雜交1824 h或過(guò)液。1.6.5洗脫及免疫熒光檢測(cè)與信號(hào)放大雜交次日，將標(biāo)本去掉蓋玻片，依次于4250 50%甲酰胺2SSC中洗滌4次，每次5 min，在1SSC中洗滌3次，每次5 min，然后將玻片置室溫2SSC中漂洗，加100200 l avidin-FITC(4SSC/1%BSA/0.1% Tween 20，按1200400比例稀釋)

15、于玻片上，37 溫育3060 min。取出標(biāo)本后，于4250 4SSC/0.1% Tween 20中洗滌3次，每次5 min，再加100200 l anti-avidin(以上述稀釋液按1100200稀釋)于玻片上，繼續(xù)于37 溫育3060 min。取出標(biāo)本后，再于4250 4SSC/0.1% Tween 20中洗滌3次，每次5 min，再加入avidin-FITC于37溫育3060 min，以放大信號(hào)，玻片洗滌同上。1.6.6染色玻片于洗滌液中取出，酒精系列脫水，每次1 min，PI/antifade復(fù)染，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡觀察結(jié)果。1.6.7顯微鏡觀察及顯微照相用Zeiss Axio

16、skop 20熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果，用Kodak Ektachrome 400ASA彩色負(fù)片顯微照相，信號(hào)的曝光時(shí)間為4050 s，復(fù)染顏色曝光時(shí)間48 s，依熒光強(qiáng)度的不同，曝光時(shí)間宜進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。2結(jié)果2.1G顯帶核型分析我們選用的胃癌細(xì)胞系SGC-7901已傳了100代以上2，生物學(xué)特性穩(wěn)定。分別對(duì)胃癌細(xì)胞系和原發(fā)性胃癌的3個(gè)G顯帶中期分裂相進(jìn)行了分析。胃癌細(xì)胞系G顯帶分裂相中有1條小標(biāo)記染色體(M1)和1條大標(biāo)記染色體(M2)；原發(fā)性胃癌的G顯帶分裂相中有1條標(biāo)記染色體(M3)。2.2FISH檢測(cè)G顯帶分析提示7號(hào)、3號(hào)染色體異常，選生物素標(biāo)記的7號(hào)染色體涂染探針，對(duì)胃癌細(xì)胞系(

17、SGC-7901)G顯帶脫色的中期分裂相染色體進(jìn)行FISH，證實(shí)M1為1條具有短臂和長(zhǎng)臂缺失的7號(hào)染色體(1)；選生物素標(biāo)記的3號(hào)染色體涂染探針，對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901的另一個(gè)G顯帶脫色的中期分裂相染色體進(jìn)行FISH，證實(shí)M2為1號(hào)染色體長(zhǎng)臂(M3) 和3號(hào)染色體短臂易位染色體(2)。選生物素標(biāo)記的7號(hào)染色體長(zhǎng)臂涂染探針，對(duì)原發(fā)性胃癌G顯帶脫色的中期分裂相染色體進(jìn)行FISH，證實(shí)M3為具有長(zhǎng)臂缺失的7號(hào)染色體(3)。1胃癌細(xì)胞SGC-7901 FISH(a)和G顯帶中期分裂相(b)對(duì)照分析探針：生物素標(biāo)記的7號(hào)染色體。箭頭所指為3條正常的7號(hào)染色體；箭頭所指為異常7號(hào)染色體(M1)。G顯

18、帶分析表明：M1為del(7)(p15)/del(7)(q22)。2胃癌細(xì)胞系SGC-7901 FISH(a)和G顯帶中期分裂相(b)對(duì)照分析探針：生物素標(biāo)記的3號(hào)染色體；箭頭指為正常的3號(hào)染色體；箭頭所指為4條異常的3號(hào)染色體，G顯帶分析表明，從上到下可見：t(1;3)(p11;q11)(M2);del(3)(q11);t(3;10)(p21;q11);t(3;5)(q11;p11)。3原發(fā)性胃癌FISH(a)和G顯帶中期分裂相(b)對(duì)照分析探針：生物素標(biāo)記7號(hào)長(zhǎng)臂；箭頭所為2條正常的7號(hào)染色體長(zhǎng)臂；箭頭所指為2條異常的染色體長(zhǎng)臂，G顯帶分析表明，從上到下可見：del(7)(q32)(M3)

19、;del(7)(q32)Fig 1The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of 7 (a) and G-banding on metaphase spread (b) from the cell line (SGC-7901) of gastric cancer. The photograph of the metaphase spread showed three normal chromosomes 7 () and one abnormal chromosome 7 (M1)().

20、 The structural changes of the M1 by G-banding analysis involved del(7)(p15)/del(7)(q22)Fig 2The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of 3 (a) and G-banding on metaphase spread (b) from the cell line (SGC-7901) of gastric cancer. The photograph of the metaphase sprea

21、d showed one normal chromosome 3 () and four abnormal chromosomes 3 (). The changes of the four abnormal chromosomes 3 by G-banding analysis involved t(1;3)(p11;q11)(M2), del(3)(q11),t(3;10)(p21;q11) and t(3;5)(q11;p11)Fig 3The contrast analysis of FISH of biotin-labeled chromosome painting probe of

22、 7q (a) and G-banding on metaphase spread (b) from one primary gastric cancer. The photograph of the metaphase spread showed two normal 7q () and two abnormal 7q(). The structural changes of the two abnormal 7q by G-banding analysis involved del(7)(q32)and del(7)(q32)3討論G顯帶脫色FISH技術(shù)國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道。Garson等3報(bào)道

23、的G顯帶法，雖然盡可能地避免了雜交信號(hào)的損失，但效果不夠理想。Hirai等4建立了可同時(shí)觀察到FISH雜交的熒光G帶技術(shù)，在基因組作方面顯示了良好的應(yīng)用前景，卻不適合與整條染色體涂染探針的FISH同時(shí)使用。我們改良的G顯帶褪色FISH技術(shù)不僅適合染色體涂染探針，也適應(yīng)于著絲粒探針，在胃癌細(xì)胞系和原發(fā)性胃癌中都獲得了良好結(jié)果，與同類技術(shù)比有信號(hào)強(qiáng)、背景低、重復(fù)性好的特點(diǎn)。直接采用FISH識(shí)別腫瘤標(biāo)記染色體來(lái)源，面臨的最大的問(wèn)題是探針的選擇5。如先對(duì)腫瘤的染色體標(biāo)本進(jìn)行G顯帶，可以了解腫瘤細(xì)胞整個(gè)染色體組的改變情況，為進(jìn)一步用FISH技術(shù)檢測(cè)提供選擇適合探針的信息。然后在原來(lái)G顯帶的核型上，選擇適

24、合的探針來(lái)證實(shí)或辨認(rèn)G顯帶分析過(guò)程中有疑問(wèn)的、或不能確認(rèn)的染色體畸變。對(duì)那些僅有部分區(qū)帶易位的異常染色體，F(xiàn)ISH的結(jié)果不能直觀地鑒別。用G顯帶標(biāo)本經(jīng)脫色后進(jìn)行FISH的方法，既能直觀地鑒別異常染色體，又能準(zhǔn)確地描繪染色體缺失或易位的斷裂位點(diǎn)。本研究中，SGC-7901細(xì)胞系中，出現(xiàn)的標(biāo)記染色體(M1)，G顯帶后用生物素標(biāo)記的7號(hào)染色體涂染探針進(jìn)行FISH，證實(shí)是一條結(jié)構(gòu)異常的7號(hào)染色體，結(jié)合G顯帶，M1為del(7)(p15)/del(7)(q22)；另一條標(biāo)記染色體(M2)，G顯帶后用生物素標(biāo)記的3號(hào)染色體涂染探針進(jìn)行FISH，證實(shí)為1和3號(hào)染色體相互易位形成，結(jié)合G顯帶，M2為t(1;3

25、)(p11;q11)；原發(fā)性胃癌中，出現(xiàn)的標(biāo)記染色體(M3)，G顯帶后用生物素標(biāo)記的7號(hào)染色體長(zhǎng)臂涂染探針進(jìn)行FISH，證實(shí)有7號(hào)染色體長(zhǎng)臂缺失，結(jié)合G顯帶，M3為del(7)(q32)。由此可見，把G顯帶技術(shù)與FISH結(jié)合起來(lái)，在用少量探針的情況下，能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)腫瘤復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)異常。顯示了該方法在識(shí)別標(biāo)記染色體來(lái)源方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)6，7。G顯帶脫色FISH技術(shù)的關(guān)鍵性步驟：常規(guī)G顯帶的染色體標(biāo)本經(jīng)甲醇脫色后，再經(jīng)常規(guī)固定液(甲醇冰醋酸31)和含有少量的MgCl2的甲醛溶液兩次固定后再作FISH，能使經(jīng)胰酶消化過(guò)的染色體標(biāo)本耐受強(qiáng)烈的變性作用而保持良好的形態(tài)，避免靶染色體DNA的斷裂

26、丟失，在G顯帶脫色后，能防止雜交信號(hào)的損失。一般在甲醛中固定2030 min為宜，對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，染色體標(biāo)本的變性時(shí)間和甲醛固定呈正相關(guān)，這可能與甲醛固定后的染色體蛋白質(zhì)改變影響染色體變性的時(shí)間有關(guān)。此外，染色體G顯帶后標(biāo)本即時(shí)放-20 冰箱保存一年，對(duì)探針的雜交質(zhì)量沒(méi)有多大影響。但通過(guò)油鏡觀察，照相后的染色體標(biāo)本不可存放時(shí)間太長(zhǎng)，過(guò)夜后的染色體標(biāo)本常常影響探針的雜交質(zhì)量，最有效的辦法是顯帶、染色，照相后立即褪色再做FISH。染色體玻片變性的時(shí)間至關(guān)重要，變性溫度相對(duì)低有利于染色體保持良好的形態(tài)。研究中發(fā)現(xiàn)，染色體標(biāo)本的變性時(shí)間和染色體老化時(shí)間呈正相關(guān)。老化時(shí)間長(zhǎng)的片子在相同的變性溫度(75)下

27、，可延長(zhǎng)一些變性時(shí)間。洗脫的溫度一般不超過(guò)50。這些步驟對(duì)G顯帶標(biāo)本脫色后進(jìn)行FISH起著關(guān)鍵性的作用。應(yīng)用該技術(shù)，不僅能通過(guò)特異性涂染探針的雜交有效地檢測(cè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色體，而且通過(guò)G顯帶分析能對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確的定位?；痦?xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(39270398)作者單位：夏建川（510060廣州，中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治中心腫瘤病理研究室）張建華（江西省衛(wèi)生廳）關(guān)新元（Laboratory of Cancer Genetics, National Institute of Health, National Human Genome Reasearch Institute, USA）劉權(quán)章（哈爾

28、濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究室）張貴寅（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究室）李璞（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究室）參考文獻(xiàn)1，Guan XY, Paul S, Meltzer, et al.Rapid generation of whole chromosome painting probes (WCPs) by chromosome microdissection. Genomics, 1994,22101-107.2，Lin CH, Fu ZM, Liu YL, et al.The establishment of human gastric cancer cell line SGC-7901.Tumor J, 1981,11-3.林超鴻，富志民，劉亞倫，等.人體胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901的建立.腫瘤，1981，11-3.3，Garson JA, Berghe JA, Kemshead JT, et al.Novel non-isotopic in situ hybridization technique detects small (1 kb) unique sequences in routinely G-banded human chromosomes: fine mapping of N-m