PDECGF特異性RNA抑制片段誘導裸鼠膀胱癌細胞凋亡的研究

1、PDECGF特異性RNA抑制片段誘導裸鼠膀胱癌細胞凋亡的研究 10-09-14 08:44:00 編輯：studa20 作者：金寧 張靈 肖博晗 常喜華【摘要】 目的 利用RNA干擾技術在裸鼠膀胱癌動物模型中通過抑制靶向沉默血小板源性內皮生長因子基因（PDECGF）的表達，探討其在活體動物腫瘤組織中的作用。方法 將psiPDECGF1及2穩(wěn)定轉染的陽性T24細胞株及其他對照組直接接種于裸鼠皮下，觀察腫瘤細胞生長及成瘤情況、測定腫瘤體積的變化；免疫組化檢查PDECGF蛋白表達；TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡。結果 裸鼠體內成瘤實驗發(fā)現siRNA2組第21天時成瘤率只有50%，而其他各組成瘤率為10

2、0%。siRNA2組生長速度明顯慢于其他3組，siRNA2組不僅成瘤延遲，且生長速度明顯慢于其他3組(P0.01)。免疫組化證實siRNA2組腫瘤組織PDECGF 蛋白表達最低; TUNEL檢測siRNA2組細胞凋亡數明顯多于其他3組 (P0.05)。結論 PDECGF siRNA載體穩(wěn)定轉染細胞株體內實驗可見膀胱癌細胞成瘤率降低，成瘤延遲及腫瘤生長速度減慢，癌細胞凋亡增多。PDECGF siRNA在裸鼠體內依然對膀胱癌細胞有明顯抑制作用。 【關鍵詞】 膀胱癌；PDECGF；RNA干擾；凋亡 【Abstract】 Objective To research the PDECGF genes f

3、unction on the animal tumor by inhibiting the expression of the PDECGF in the nude mice bladder carcinoma animal model via siRNA system.Methods The bladder carcinoma nude mice model was established by the stable transfected bladder carcinoma cells to observe tumors growth and detect the tumor cells

4、apoptosis by TUNEL kit which can assay sliced DNA in tumor cells.Results The form rate of tumor was only 50% in 21st day after inoculation of T24 cell in siRNA2 group through bearing tumor experiment in vivo. The rate of form tumor was 100% in other groups. The growth velocity was slower in RNAi2 gr

5、oup than that of other groups(P0.01). The expression of PDECGF protein was lowest in siRNA2 group. The cell apoptosis counts in siRNA2 group was most than that of other groups significantly (P0.05). Conclusions PDECGF siRNA can still depress the bladder tumor in nude mice with the decreased tumor fo

6、rming rate and prolonged tumor forming time and the reduced tumor growth speed and the increased apoptosis cells. 【Key words】 Bladder carcinoma; PDECGF；RNA interference; Apoptosis 血管內皮生長因子（VEGF）與血管形成密切相關，是最重要的一種血管生長因子。腫瘤組織VEGF表達直接影響著腫瘤血管的生長和原發(fā)瘤的生長與浸潤1。血小板源性內皮生長因子基因（PDECGF）作為VEGF超家族中的一分子在腫瘤的發(fā)病過程中具有重要

7、作用。腫瘤生長具有血管依賴性，惡性腫瘤的侵襲性生長、轉移及其預后依賴于血管生成，沒有血管網絡的滋養(yǎng)和帶走新陳代謝廢物腫瘤細胞就無法生存2。抑制血管生成能有效抑制腫瘤生長，因此抑制血管生成技術或藥物可用于治療腫瘤。封閉PDECGF基因是治療實體腫瘤的新思路。通過抑制或阻斷VEGF在腫瘤組織表達，切斷PDECGF對血管內皮細胞的作用，抑制腫瘤的血管生成，對抑制腫瘤的生長和轉移有重要意義。前期研究己經在體外實驗中得到較為肯定的PDECGF RNAi抑制膀胱癌細胞的效果3。為了進一步研究RNAi的體內抑瘤情況，通過裸鼠皮下成瘤實驗檢測生物體內psiPDECGF2對T24細胞致瘤能力的影響，為證實臨床基

8、因治療膀胱腫瘤可行性打下初步的實驗基礎，以為臨床治療膀胱癌提供新的切入點。 1 材料與方法 1.1 psiPDECGF穩(wěn)定轉染細胞系的構建 按分子克隆技術將psiPDECGF1及2等質粒3轉染入T24細胞，經G418篩選，用未轉染的T24細胞做對照。對照細胞完全死亡后，再次用G418篩選。分為對照組、空載體組、siRNA1對照組以及siRNA2組。 1.2 裸鼠膀胱癌模型的建立 裸鼠共24只，隨機分為4組，每組各6只。100 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)各組穩(wěn)定轉染的細胞直至對數生長期，0.25%胰酶消化并計數，離心后取200 1(1105個細胞/l)懸浮細胞，加入不含血清的DMEM制成細胞懸液，選擇裸鼠右

9、側臀部外側，消毒后進行皮下注射；每日觀察成瘤情況，成瘤后每3 d稱量裸鼠體重及測量腫瘤大小，記錄腫瘤潛伏期及繪制腫瘤生長曲線，計算成瘤率、腫瘤抑制率和腫瘤生長指數。第30日脫頸法處死裸鼠，解剖取腫瘤組織，稱重，做病理切片檢查。用公式分別計算腫瘤體積、腫瘤抑制率和腫瘤生長指數。計算公式如下：腫瘤體積=腫瘤長徑腫瘤短徑20.5。腫瘤抑制率(%)= (對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重100%。 1.3 裸鼠腫瘤組織切片HE染色 瘤體常規(guī)福爾馬林固定，制作石蠟切片；脫蠟后，蘇木精染色10 min，水沖洗后，加鹽酸酒精(1%鹽酸，70%酒精)8 min，自來水沖洗15 min，逐級脫水，70%，80%，90%酒精各5 min，進行伊紅染色5 min，再浸入90%酒精5 min，2次100%酒精各5 min，脫水干燥，封片照相。 1.4 裸鼠腫瘤組織PDECGF免疫組化 按照常規(guī)方法進行。一抗孵育濃度為150(PBS稀釋)，生物素化的二抗孵育濃度為1200，計算機病理切片圖像采集和分析，每張切片免疫組化半定量分析，取5個高倍鏡下視野(400)，統計圖片陽性染色細胞的平均積分光密度(IOD)值，以判斷陽性染色的差異。 1.5 TUNEL法檢測凋亡細胞數 采