實驗三植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

1、實驗三 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一、 實驗?zāi)康牧私饧?xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。二、實驗器具及試劑1器具普通光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙。2試劑M-緩沖液：咪唑、KCL、MGCL2、EGTA【乙二醇雙醚四乙酸】、EDTA、疏基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇)；（PH6.8）磷酸緩沖液（用NaHCO3調(diào)PH值）；Triton X-100，用M-緩沖液配制；考馬斯亮藍(lán)R250,其溶劑為：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml；戍二醛、乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性樹膠等。3. 實驗材料洋蔥鱗莖三、實驗內(nèi)容細(xì)胞骨架事

2、由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長、運動、分裂、分化，物質(zhì)運輸，能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達(dá)等起到重要作用。當(dāng)用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細(xì)胞時，可經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)用戊二醛固定，考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，就是細(xì)胞骨架。（一）溶液配制（1）M-緩沖液配制：M-緩沖液(10原液) ：咪唑34.04g，氯化鎂 (MgCl26H2O)1.02g，EGTA（乙二醇雙醚四乙酸） 3.8g

3、，EDTA (乙二胺四乙酸)0.29g，巰基乙醇0.78g (0.7ml)蒸餾水加至1 000 ml。使用時，取100 ml (10原液)加900 ml蒸餾水。（2）6mmol/L（PH6.5）磷酸緩沖液配制：甲液：NaH2PO42H2O，0.938g 溶于蒸餾水中，最后稀釋至1 000ml。乙液：Na2HPO4 12H2O，2.15g加蒸餾水溶解，最后加水至1 000ml。取甲液685ml，乙液315ml加蒸餾水1000ml即成6mmol/LPH6.5的磷酸緩沖液。（3）1%Triton X-100，用M-緩沖液配制：取22ml Triton X-100液加M-緩沖液至200ml。（4）0.

4、2%考馬斯亮藍(lán)R250：考馬斯亮藍(lán)R250為0.2g，甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml（5）3%戍二醛，用磷酸緩沖液配制。（二）實驗方法與步驟（1） 撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮（約1cm2大小若干片）置于裝有PH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉。（2）吸去磷酸緩沖液，用1% Triton X-100處理2030min。（3）吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10min。（4）3%戊二醛固定0.51h。（5）PH6.5磷酸緩沖液洗三次，每次10min。（6）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色2030min。（7）用蒸餾水洗12次，細(xì)胞置于載破片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。（8）如觀察效果好，可制作成永久切片。在有樣品的50ml燒杯中，順序通過如下藥物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2V95%乙醇+1/2V叔丁醇、叔丁醇（每級5-10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每級5-10min），然后撈取樣品，平展于載玻片上，經(jīng)鏡檢，