靈芝三萜的提取分離及總?cè)频暮繙y(cè)定

1、 70 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐2010年第24卷第5期Chin Med J Res Prac,2010 Sept.,Vol.24 No.5靈芝是一種名貴的藥用真菌，屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，始載于«神農(nóng)本草經(jīng)»，具有補(bǔ)中益氣、滋陰強(qiáng)壯、扶正固本、延年益壽等功效。靈芝主要成分為多糖類和三萜類。三萜類成分復(fù)雜，曾祥麗等1報(bào)道靈芝含有122種三萜類成分，其中最主要是靈芝酸37種。林志彬等研究認(rèn)為靈芝三萜具有抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、保肝、抗腫瘤和抗艾滋病毒等藥理活性2-5。本文對(duì)靈芝三萜的提取分離及總?cè)频暮繙y(cè)定作以下報(bào)道。1 儀器、試劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（

2、日本生產(chǎn)，EYELA ROTORYEVAPOPATOR N-1000）；GB204電子天平（瑞典）；751型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海分析儀器靈芝三萜的提取分離及總?cè)频暮繙y(cè)定侯敏娜1，劉 劍 2（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712046；2. 陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)責(zé)任公司， 陜西 商洛 726000）摘要：目的 研究靈芝三萜的最佳提取方法，并測(cè)定其總?cè)频暮俊?方法 采用正交實(shí)驗(yàn)方法，用硅膠柱進(jìn)行總?cè)品蛛x，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總?cè)坪俊?結(jié)果 最佳提取方法為用5倍量95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h ；用 30倍量硅膠裝柱，以石油醚-乙酸乙酯（9：1和7：3）進(jìn)行洗脫

3、；經(jīng)分離得到針狀晶體和，測(cè)定該品種中靈芝總?cè)坪繛?.07%。 結(jié)論 本提取方法穩(wěn)定可行，可作為靈芝三萜工業(yè)化生產(chǎn)的參考。關(guān)鍵詞：靈芝三萜; 提取分離 ; 含量測(cè)定中圖分類號(hào)：S567.3+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-6427(201005-0070-02 Ganoderma Triterpenoids Extraction and Determination of the Total TriterpenoidHOU Min- na1 , LIU Jan2(1.Shananxi Institute of International Trade & Commerce, Xi

4、anyang 712046, China ;2. Shananxi Xiangju Pharmaceutical Group Co., Shangluo 726000,ChinaAbstract: Objective To design the best out of Ganoderma triterpenoids extract programs and separation methods, and measured the total content of triterpenoid. Methods Filter through the orthogonal extraction met

5、hod, using silica gel column for the total separation of triterpenoids by ultraviolet - visible spectrophotometry triterpenoid content. Results The optimum extraction method is to use ve times the amount of 95% ethanol was extracted three times for 1.5 hours each time; loaded with 30 times the amoun

6、t of silica gel column with petroleum ether - ethyl acetate (9:1 and 7:3 for elution; by ultraviolet - visible spectrophotometry in order to ursolic acid as a reference substance, the total triterpene content of Ganoderma lucidum were determined. Conclusion The extraction method is stable and feasib

7、le, and Ganoderma triterpene content was to 9.07%.Key words: Ganoderma lucidum Triterpenes; extraction and separation; content determination廠）；硅膠G （青島高能達(dá)化工有限公司）；薄層層析硅膠板HSGF254（煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司）、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等試劑均為分析純，熊果酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）。2 方法2.1 靈芝三萜的提取方法 靈芝三萜屬于脂溶性成分，通常用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑、提取次數(shù)、時(shí)間及其用量4個(gè)試驗(yàn)因

8、素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以熊果酸為對(duì)照品測(cè)得的總?cè)坪孔鳛榭疾熘笜?biāo)，選用L 9（34）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。收稿日期：2009-10-20作者簡(jiǎn)介：侯敏娜（1981-），女， 碩士研究生，主要從事藥物制劑教學(xué)和研究工作。表1 因素水平表Tab.1 Factors and level水平123提取溶劑A 氯仿95%乙醇甲醇提取時(shí)間（h）B 11.52.0提取次數(shù)（次）C 123溶劑用量（倍）D 357 71 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐2010年第24卷第5期Chin Med J Res Prac,2010 Sept.,Vol.24 No.5 各因素對(duì)靈芝總?cè)铺崛」に囉?/p>

9、響大小為：C>B >A>D，經(jīng)各方面綜合考慮后，最終選出最佳提取工藝為：5倍量95%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。2.2 靈芝干浸膏制備方法 稱取干燥靈芝粗粉4 000 g ，加入5倍量的95%乙醇回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾，濾液水浴（5060 ）蒸干得浸膏345.26 g，加水使充分溶解，用等量的氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓回收至適量，水?。?060 ）蒸干得浸膏82.86 g。2.3 靈芝三萜的分離方法 將上面所得浸膏用適量乙酸乙酯充分溶解，揮至少量, 用2倍量硅膠拌樣，30倍量硅膠裝柱，先用石油醚-乙酸乙酯（9：1）洗脫，洗脫液每100 mL收集一次，至洗脫液

10、近無(wú)色（在硅膠HSGF 254板上點(diǎn)樣無(wú)斑點(diǎn)顯示）時(shí)，再用石油醚-乙酸乙酯（7：3）洗脫，合并第49至73流份，減壓回收至少量，自然揮干，得粗晶4.139 3 g，用少量乙酸乙酯溶解，2倍量硅膠拌樣，100倍量硅膠裝柱，用石油醚-乙酸乙酯（7：3）洗脫，洗脫液每30 mL收集一次，合并第933和3444流份，分別減壓回收至適量，用甲醇反復(fù)重結(jié)晶，可得白色針狀晶體(1.862 4 g和白色針狀晶體(0.546 8 g。3 靈芝總?cè)频暮繙y(cè)定3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取熊果酸對(duì)照品1.15 mg，溶于10.00 mL乙酸乙酯中，混合均勻得對(duì)照品溶液。分別吸取0.00、0.10、0.20、0.40、

11、0.60、0.80、1.00和1.20 mL對(duì)照品溶液，在100水浴上蒸干后加入0.40 mL 5香草醛一冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60 水浴中加熱15 min后移入冰水浴中，再加入5.00 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫。15 min后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在548.1 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照品重量在00.14mg 范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y =0.140 8X +0.002 6，相關(guān)系數(shù) r =0.999 1。3.2 直接光度法測(cè)定 取靈芝樣品5.0010.00 mg，溶于10.00 mL乙酸乙酯中。分別吸取定體積的該溶液，

12、在100 水浴上蒸干后加入0.40 mL 5香草醛一冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，于60 水浴加熱15 min后移入冰水浴中，再加入5.00 mL冰乙酸，搖勻后置于室溫。15 min后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在548.1 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品溶液的吸光度。結(jié)果表明，該品種靈芝中總?cè)坪繛?.07%。4 結(jié)論靈芝的藥用成分，主要是其中含有的多糖和三萜成分，而三萜化合物分子功能團(tuán)較多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣且不穩(wěn)定，容易隨溫度的變化而改變，所以在提取時(shí)溫度的控制是關(guān)鍵。靈芝三萜具有廣泛的藥理活性6，它的提取分離已基本上完成，但是，對(duì)于具體靈芝三萜的結(jié)構(gòu)確定及其藥理作用的研究有待下一步完成。參考文獻(xiàn)1 曾祥

13、麗, 包海鷹. 靈芝三萜類成分與藥理學(xué)研究進(jìn)展J.菌物研究,2004,2(1:68-77.2 羅 俊, 林志彬.靈芝三萜化合物藥理作用研究發(fā)展J. 藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,37(7:42-46.3 El-Mekkawy S,Meselhy,Nakamura N,et a1.Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease from Ganoder maluciduma J, Phytochemistry.1998,49 (6:1651-1657.4 王 斌, 胡岳山, 李杰芬.靈芝三萜對(duì)小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞增殖的影響J.中藥材,2005,28(7:21-25.5 周昌艷, 唐慶九, 楊 焱, 等. 靈芝中有效成分靈芝酸的抑制腫瘤作用研究J.茵物學(xué)報(bào),2004,23(2: 275-279.6 馬 林, 吳 豐, 陳若蕓.靈芝三萜成分分析J.藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,38(1:61-68.表2 L9（34）正交試驗(yàn)表Tab.2 Results of the orthogonal test列號(hào)123456789RA11122233326.3626.6926.840.48B 12312312326.3727.2826.360.92C 12323131225.5326.5127.872.34D 12331223126.5