大曲中紅曲霉的簡易分離方法

1、大曲中紅曲霉的簡易分離方法 李曉樓 （四川職業(yè)技術學院，四川 遂寧 629000 ） 摘 要 ： 本文采用無菌過濾收集大曲中紅曲霉孢子懸液和基內接種技術，運用稀釋平板法，實現了從大曲中簡易分離紅曲霉，文章介紹了紅曲霉的生物學特征，闡述了從大曲 中分離紅曲霉的原理、分離培養(yǎng)基的設計與制作、大曲中紅曲霉分離純化的技術方法及過程，為獲取紅曲霉純菌及紅曲生產愛好者提供參考。 關鍵詞： 大曲；紅曲霉；分離；基內接種；稀釋平板法     紅曲霉的用途非常廣泛，利用紅曲霉生產紅曲，古稱丹曲，是我國古代的偉大發(fā)明。紅曲不但用于釀酒，而且還應用于發(fā)酵食品、食品色素等方面 1 。此外

2、有的紅曲霉能產生 Monacolin 類活性物質，具有很強的降低膽固醇的作用；某些紅曲霉種還含有較高的麥角甾醇，可防止嬰兒佝僂病，促進孕婦和老年人對鈣、磷的吸收；另外有報道紅曲霉的有些種還有酯化能力 2 。 因此有關紅曲霉在釀酒、保健、食療等方面的作用越來越受到人們的重視。本文采用無菌過濾收集大曲中紅曲霉孢子懸液和基內接種技術，運用稀釋平板法，實現了 從濃香型大曲中簡易分離紅曲霉，文章介紹了紅曲霉的生物學特征，闡述了從大曲中分離紅曲霉的原理、分離培養(yǎng)基的設計與制作、大曲中紅曲霉分離純化的技術方 法及過程，為獲取紅曲霉純菌及紅曲生產愛好者提供參考。 1 紅曲霉的生物學特征   

3、;  紅曲霉（ Monascus sp . ）是腐生菌，分布較廣，常存于乳品或乳制品中，多數出現在乳酸自然發(fā)酵的基物里，制曲作坊和大曲等都是它們適宜的繁殖地。紅曲霉屬于不整子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科、紅曲屬。已描述過的紅曲霉約有 19 個種 3 。   1.1 形態(tài)特征     紅曲霉一般多用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)。在生長的過程中能形成紅色色素，菌落初為白色，老熟后變成淡紅、紫紅等顏色。菌絲有隔，多核，多分枝。分生孢子著生在菌絲 及其分枝的頂端，單生或以向基式生出 2 6 個成鏈，形狀多為梨形，閉囊殼球形，內散生 10 多個子囊，子囊球形，內含有 8

4、個子囊孢子，成熟后子囊壁解體，孢子留在閉囊殼內 4 。   1.2 生理特性     紅曲霉的最適溫度一般在 30 35 ， 25 以下 40 以上不利于生長。最適 pH 值一般在 3 5 ， pH 值在 3 以下，生長緩慢， pH 值在 5 以上，不利于色素的形成。同時釀酒用的紅曲霉能夠耐受一定的酒精度 4 。 2 大曲中紅曲霉的分離原理     根據紅曲霉的生物學特征以及生理特性，在適合紅曲霉生長的培養(yǎng)基中加入選擇性抑制劑，設計制作成適合紅曲霉生長的選擇性分離培養(yǎng)基，選取富含紅曲霉的優(yōu)質大曲為菌源，無菌過濾，收集紅曲霉孢

5、子懸液，采用稀釋平板分離可以得到較純紅曲霉 5 。 3 分離培養(yǎng)基的設計與制作     選擇性分離培養(yǎng)基的設計與制作，是成功分離紅曲霉的關鍵。設計與制作紅曲霉選擇性分離性培養(yǎng)基，包括設計原理；配方以及制作過程。   3.1 設計原理     選擇性分離培養(yǎng)基是利用目的微生物對各種化學物質敏感程度的差異，在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制劑，用以抑制非目的微生物的生長，并使目的微生物生長繁殖，從而實現紅曲霉的純種分離。   3.2 具體配方     根據紅曲霉分離的原理，設計麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基加選擇

6、性抑制劑用于紅曲霉分離。具體配方： 8 10 波美度的麥芽汁 900ml ，無水乙醇 100ml ， 25g 瓊脂，然后用乳酸調 pH 值在 4.0 左右， 1.05kg /cm 2 滅菌 20 分鐘即成選擇性分離培養(yǎng)基。使用前加 30ppm 的鏈霉素 1ml 2ml ，用于抑制原核微生物如細菌和放線菌的生長。   3.3 制作過程     取小麥若干，用水洗凈，浸水 6 12 小時， 15 陰暗處發(fā)芽，當麥根長至麥粒的兩倍時，攤開烘干。將干麥芽磨碎，取 1 份麥芽加 4 份水，在 65 水浴鍋中糖化 3 4 小時，然后用 4 6 層紗布過濾，濾液用雞蛋

7、清法除濁后稀釋到 8 10 波美度。按 3.2 設計配方配制， 1.05kg /cm 2 滅菌 20 分鐘即成 5 。 4 大曲中紅曲霉的分離方法與技術   4.1 方法     稀釋平板法 （ pour plate method) 即 運用無菌操作， 將目的菌源微生物用無菌水作梯度稀釋，取定量菌液通常不超過 1ml 于無菌培養(yǎng)皿中，然后倒入融化冷卻至 50 的培養(yǎng)基，混合搖勻，凝固后倒置、恒溫培養(yǎng) 1 3 天，就會出現單菌落，達到純種分離的目的。稀釋平板法，接種溫度較高，接種器具簡單，適合于利用孢子懸液等分離。   4.2 技術  

8、   根據紅曲霉的生物學特征及其生理特性在紅曲霉的分離純化過程中主要采用了基內接種技術和無菌過濾收集孢子懸液技術。   4.2.1 基內接種技術     基內接種技術是相應于稀釋平板法而言的，菌液接種于培養(yǎng)基的內部，菌液與培養(yǎng)基充分混合，基內接種技術，接種溫度較高，可使 某些熱敏感菌死亡 ，同時培養(yǎng)基內部缺氧，某些好氧菌的生長受到抑制，可減少非目的微生物在培養(yǎng)基上的生長，而紅曲霉的孢子有一定的耐受性和抗逆力，因此影響不大。   4.2.2 無菌過濾收集紅曲霉孢子懸液技術     采用無菌過濾收集

9、紅曲霉孢子懸液，用于紅曲霉純菌分離，可以縮短分離純化的次數，確保分離培養(yǎng)基平板上的紅曲霉菌落是單菌落，同時紅曲霉孢子的耐受力較強，有一定的抗逆性，適合基內接種。   4.2.2 .1 無菌過濾裝置的準備     用一玻璃短柄漏斗，在漏斗柄和頸結合處包棉花成棉塞狀，將漏斗柄插放到試管或三角瓶內，棉塞要松緊適宜（以手握漏斗，試管或三角瓶不掉為準），漏斗內放折疊好的圓錐形濾紙，要求濾紙邊緣低于漏斗邊緣，然后用牛皮紙將整個漏斗包扎，滅菌備用。   4.2.2 .2 無菌過濾操作     用無菌小刀在漏斗的牛皮紙上劃一銳角形

10、小口，在無菌環(huán)境中，用無菌鑷子掀起小口，將待濾樣液緩緩倒入漏斗，樣液不要超過濾紙邊緣。完畢后，輕輕取下漏斗，保留棉塞，注意旋轉一下棉塞，以消除棉塞中部的小孔。所得濾液即為基內接種的孢子懸液。 5 大曲中紅曲霉的分離純化過程   5.1 大曲的選取     選取有紅心的優(yōu)質中高溫大曲，無菌粉碎備用。紅心大曲的選取，目的性強，可以縮短分離時間，減少分離過程中目的菌種的富集培養(yǎng)。   5.2 紅曲霉的分離     從紅心大曲中分離得到紅曲霉純菌，要經過一系列的過程，在整個過程中，無菌操作和無菌意識顯得尤為重要，包括以下過

11、程。   5.2.1 無菌水的制備     量取 90ml 蒸餾水于 250ml 三角瓶中，塞上棉塞，包扎，另取 2 支 18mmX180mm 的試管，分裝 9ml 蒸餾水，塞上棉塞，包扎。 1.05kg /cm 2 滅菌 20 分鐘。   5.2.2 紅曲霉孢子懸液的制備與稀釋     將無菌粉碎的紅心大曲粉 10g 浸泡在裝有 90ml 無菌水的三角瓶中振蕩 20 分鐘，無菌過濾，濾液即為 10 -1 濃度的紅曲霉孢子懸液 ，用 1ml 的無菌滴管吸取 10 -1 濃度的孢子懸液 1ml 于一管 9ml 的無菌

12、水中，吹洗三次，搖勻得 10 -2 濃度的紅曲霉孢子懸液 ，同樣到 10 -3 濃度的紅曲霉孢子懸液。   5.2.3 平板分離     取 9 套無菌培養(yǎng)皿，依次編號為 10 -1 ， 10 -2 ， 10 -3 ， ， 每個稀釋度設兩個重復即各三個。采用基內接種技術，用 1 支 1 ml 無菌滴管從低濃度開始，分別吸取 1ml 菌液于相應編號的培養(yǎng)皿內，要求吸前搖勻樣液。 然后將融化冷卻到 50 左右的分離培養(yǎng)基（向培養(yǎng)基中加入 30ppm 的鏈霉素 1 2ml ，）倒平皿，旋轉平皿，使培養(yǎng)基和孢子懸液充分混勻。冷凝后倒置于培養(yǎng)箱中 32 恒溫 培養(yǎng)

13、 2 4d ，注意觀察菌落的形態(tài)和顏色。   5.2.4 紅曲霉的轉接     從稀釋平板上選取菌落初為白色，老熟后變紅、紫紅的菌落無菌操作轉接到麥芽汁瓊脂試管斜面上 32 恒溫 培養(yǎng) 6 7d ，作好標記。   5.2.5 紅曲霉的純化     如果轉接的菌苔不純，可在培養(yǎng) 7 天左右后，向試管中無菌操作加入 10ml 無菌水，用接種鏟刮洗菌苔，無菌過濾，將濾液按 5.2.2 、 5.2.3 操作，進一步純化、培養(yǎng)、轉接即得紅曲霉純種。注意純化時孢子懸液的稀釋度，最好取 10 -3 ， 10 -4 ， 10 -5

14、 三個稀釋度，因為此時的菌相當于經過了富集培養(yǎng)，較純，孢子數量大，濃度較高。   5.2.6 鏡檢     取潔凈的無菌載玻片，加一滴乳酸石碳酸液。用接種針挑取分離轉接的試管紅曲霉菌絲少許，在液滴中涂布，蓋上蓋玻片，火焰固定后鏡檢。觀察菌體的形態(tài)、菌絲 的形態(tài)、有無橫隔，分枝情況；分生孢子著生方式、形狀；有無閉囊殼及其形狀等鑒定是否是紅曲霉。鏡檢后將確定的紅曲霉菌種作好標記。   5.2.7 紅曲霉菌種的保藏     將分離得到的純種紅曲霉作好標記后冰箱保存?zhèn)溆?。在實踐生產中可以用試管麩皮法保存紅曲霉，該方法簡單、實用，保存時間較長。     總之，采用上述方法，從大曲中分離紅曲霉，目的性強，成功率高，簡便易行，耗時短，同時分離得到的紅曲霉來源于大曲，有一定的糖化力和耐酸性，在實際生產上有更大的實用價值。 參考文獻： 1 傅金泉我國紅曲生產與應