獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)的基本技術(shù)

1、獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)的基本技術(shù)【知識目標】熟悉 獸醫(yī)生物制品菌(毒種的概念及保存; 病毒增殖方法; 實驗動物的分類及特點; 實驗動物的概念; 實驗動物的正確選擇。 理解 細菌的生長繁殖規(guī)律; 病毒的組織細胞培養(yǎng)。掌握 細菌培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的制備; 禽胚培養(yǎng)技術(shù); 掌握實驗動物的捕捉、保定和采血技術(shù)。了解 獸醫(yī)生物制品菌種、毒種的分類及選育與鑒定; 細菌生長繁殖的營養(yǎng)要求; 實驗動物的繁育與生產(chǎn)管理?！灸芰δ繕恕磕苓M行細菌培養(yǎng)、禽胚培養(yǎng)等操作;能應(yīng)用動物實驗技術(shù)。第一節(jié) 菌種與毒種選育技術(shù)一、菌(毒種的概念與分類菌(毒種是國家的重要生物資源,世界各國對這項資源都極為重視,并設(shè)置各種專業(yè)性保藏機構(gòu),現(xiàn)

2、在不少國家的菌種與毒種中心都采用計算機進行管理。我國于1980年成立了獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心,設(shè)在中國獸藥監(jiān)察所(簡稱中監(jiān)所,專門從事獸醫(yī)微生物菌種的收集、保藏、管理、交流和供應(yīng)。(一、菌(毒種的概念獸醫(yī)生物制品的菌種與毒種是指應(yīng)用于獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)、檢定和研究的細菌菌種、病毒毒種以及分類地位在原蟲以下的生物種,主要指獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)、檢定用的菌種與毒種。(二、菌(毒種的分類獸醫(yī)生物制品用的菌(毒種,按其存獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)、檢定過程中的用途可分為四類:1.生產(chǎn)用的菌(毒種(1 直接生產(chǎn)用的菌(毒種生物秀專心做生物!易生物-領(lǐng)先的生物醫(yī)藥商務(wù)平臺 生物秀論壇-學術(shù)交流,資源共享,互助社區(qū)直接

3、用本微生物或其產(chǎn)物制備疫苗、類毒素、診斷抗原等生物制品,參與制品的加工與處理,如制備新城疫油佐劑火活疫苗的新城疫病毒,制造破傷風類毒素的破傷風棱菌,生產(chǎn)雞白痢全血玻板凝集抗原的雞白痢沙門氏菌等。(2 免疫用的菌(毒種主要用于生產(chǎn)免疫血清和診斷血清,如制備小鵝瘟免疫血清的小鵝瘟病毒,制備炭疽沉淀素的炭疽桿菌。(3 加工用的菌(毒種應(yīng)用于獸醫(yī)生物制品的加工過程,如制備沙門氏菌單因子血清時,先用某種沙門氏菌免疫家兔獲得的免疫血清為群因子血清,再用與上述菌有類屬抗原的沙門氏菌吸收掉血清中的類屬抗體便獲得單因子血清,后者(吸收菌就是參與加工的菌種。2.工具菌(毒種在獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中作為工具使用,如生產(chǎn)

4、痢疾桿菌噬菌體用的痢疾桿菌。3.檢定用的菌(毒種用于獸醫(yī)生物制品某些項目的檢驗,如疫苗效力檢驗攻毒用的強毒菌(毒種,園子血清效價及特異性測定用的苗(毒種。4.標準菌株或參考菌株在研究或其他特殊問題鑒定等方面使用,一般不用于生產(chǎn)獸醫(yī)生物制品。二.菌(毒種的一般要求菌(毒種是決定獸醫(yī)生物制品質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。制備的疫苗必須安全有效,診斷制劑必須敏感特異,所以必須按照要求進行嚴格的選擇與鑒定,符合標準者才能用于生產(chǎn)獸醫(yī)生物制品。1.來源清楚,資料完整由專門機構(gòu)保管、分發(fā)的獸醫(yī)生物制品用菌(毒種,其來源、分離和傳代的歷史、生物學特性以及免疫學特性、安全與效力檢定等資料,有關(guān)審批單位的鑒定、結(jié)論及審核

5、批示材料均應(yīng)清楚。任何來歷不明或傳代歷史不清的菌(毒種,不能用于獸醫(yī)生物制品的生產(chǎn)。我國現(xiàn)有用于生產(chǎn)疫苗的菌(毒種都是由研究單位進行大量研究工作之后選出的。獸醫(yī)生物制品制造及檢驗規(guī)程規(guī)定,凡經(jīng)農(nóng)業(yè)部或者省(自治區(qū)局發(fā)給批準文號的產(chǎn)品,生產(chǎn)所需的菌(毒種,由中監(jiān)所或中監(jiān)所委托分管的單位負責供應(yīng)。除中監(jiān)所和受委托的分管單位外,生物制品廠和其他任何單位不經(jīng)批準,不得分發(fā)和轉(zhuǎn)發(fā)生產(chǎn)用的菌(毒種。目前我國獸醫(yī)生物制品菌(毒種管理有三種情況: 中監(jiān)所統(tǒng)一保管; 各地菌種由中監(jiān)所統(tǒng)一鑒定,如大腸桿菌;中監(jiān)所委托有關(guān)單位代管。如委托中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所管理豬丹毒GC42菌苗株、布魯氏菌羊種5號菌苗株

6、等;委托中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所代管口蹄疫O型II系疫苗株。2. 生物學特性典型生物學特性包括菌(毒種的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性、毒力特性和免疫學特性等,應(yīng)當符合相應(yīng)的標準。獸醫(yī)生物制品主要是用于免疫預(yù)防、免疫治療和免疫診斷的生物制劑,生產(chǎn)用菌(毒種的篩選必須以抗原性優(yōu)良為前提條件。如制造疫苗用的菌(毒種,必須具有良好的免疫原性,生產(chǎn)診斷抗原的菌(毒種應(yīng)當具有很強的反應(yīng)原性。3. 血清型相符在選擇菌(毒種制備獸醫(yī)生物制品時,需特別注意菌(毒種的血清型是否與使用地區(qū)流行疫病的病原血清型相符,相符者才能保證使用效果。4. 遺傳性狀穩(wěn)定純一菌(毒種是個相對群體,在保存、傳代和使用過程中,受各

7、種因素影響容易發(fā)生遺傳性狀的改變,這種改變主要表現(xiàn)在形態(tài)和培養(yǎng)特性、毒力和抗原性等方面,因此要求群體變異幅度必須有嚴格的限制。如果制備弱毒疫苗的菌(毒種個體間產(chǎn)生較大的毒力和抗原性差異,那么制品的質(zhì)量可能會受到嚴重影響。為保證菌(毒種的穩(wěn)定性與純一性,應(yīng)經(jīng)常對其進行挑選、純化或克隆化,如羊痘雞胚化毒種在經(jīng)過羊體傳24代復壯,純化后方能用于制備疫苗。5. 毒力在規(guī)定范圍內(nèi)制備不同的獸醫(yī)生物制品,所用菌(毒種在保證良好的抗原性這一前提下,具有不同的毒力要求。制備滅活疫苗可選用強毒株,而制造弱毒疫苗所用的苗(毒種毒力要盡可能弱些。通過保護力試驗檢驗疫苗、免疫血清的效力,應(yīng)當用強毒株進行攻毒。三、菌(

8、毒種的鑒定(一、致病力測定菌(毒種的致病力(或稱毒力常用易感實驗動物、本動物(原宿主動物、禽胚或細胞進行測定,用半數(shù)致死量(LD50、半數(shù)感染量(ID50、禽胚半數(shù)致死量(ELD50、胚半數(shù)感染量(HD50、組織細胞半數(shù)感染量(TCID50等來表示。測定致病力時,必須設(shè)陽性和陰性對照,否則結(jié)果不成立。設(shè)陰性對照的目的是闡明所用動物、禽胚或細胞等是否正常健康,設(shè)陽性對照的目的是闡明所用動物、禽胚或細胞對接種物的敏感性。具體的測定方法是:將培養(yǎng)物連續(xù)遞進稀釋,將不同的稀釋度定量接種一定數(shù)量的動物(禽胚或細胞,統(tǒng)計被接種動物在規(guī)定時間內(nèi)的發(fā)病或死亡數(shù)(細胞病變數(shù),按ReedMuench法、內(nèi)插法或K

9、arber法計算半數(shù)劑量,數(shù)字越小說明致病力越強。以測定LD50為例:將某病毒培養(yǎng)物進行10倍遞進稀釋后,取幾個連續(xù)的稀釋度分別接種小鼠5只,每只接種量為0.1ml,統(tǒng)計在規(guī)定日期內(nèi)死亡、生存及其累積數(shù)(表3-1。以ReedMuench法計算結(jié)果,公式為:比距(L:(高于50%的死亡率-50%/(高于50%的死亡率一低于50%的死亡率,lgLD50=死亡率高于50%的稀釋度的對數(shù)一L稀釋倍數(shù)的對數(shù)。將數(shù)值代入公式:L=(86-50/(86-33=0.68,lgLD50=lgl0-0 681=-8.68。LD50=10-8.68,表示該病毒稀釋至10-8.68時,每只小鼠接種0.1ml,能使50

10、%的小鼠死亡。 (二、抗原性測定抗原性包括抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的反應(yīng)原性和抗原刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞的免疫原性。反應(yīng)原性測定,一般采用血清學方法,以抗體滴度或效價表示。免疫原性測定,通常采用的方法是將菌(毒株制成疫苗,免疫動物,經(jīng)13周后用致死劑量的強毒攻擊,以保護率表示。抗致死量強毒越多,保護率越高者,免疫原性越好。抗原性的測定,也需設(shè)陽性和陰性對照,否則無效。(三、穩(wěn)定性測定一般采用培養(yǎng)基或動物、禽胚、細胞對菌(毒株進行傳代培養(yǎng),觀察其生物學特性,測定其致病力和抗原性,以證明其遺傳性狀的穩(wěn)定。四、菌(毒種的保存冷凍真空干燥法是目前保存菌(毒種最好的方法。通過鑒定符合要求的菌(毒

11、種經(jīng)增殖后加入保護劑,分裝后進行凍干。凍干的細菌菌種4保存;凍T的病毒毒種-20以下保存,有條件的放在液氮中(-196保存效果更好。凍干的菌(毒種在上述溫度條件下可保存多年,性狀不發(fā)生明顯改變。凍干的菌(毒種不應(yīng)再通過動物傳代,以免混入動物內(nèi)源性病毒。如果經(jīng)過動物傳代,應(yīng)重新分離、檢測和鑒定,合格后方能作種子用。五.菌(毒種的選育(一、強毒菌(毒種的選育強毒菌(毒種廣泛用于制備滅活疫苗、診斷制劑、免疫血清等生物制品,也用于生物制品的效力檢驗以及人工育成弱毒株的原始毒株。在某一個疫病流行地區(qū),在疫病流行初中期,癥狀及病理變化典型而又未經(jīng)任何治療的患病動物體內(nèi)可分離到毒力強大、抗原性良好的毒株。然

12、后,從各地分離的自然強毒菌(毒株中篩選出符合標準的毒株,作為生物制品的苗(毒種。如我國的石門系豬瘟病毒和多殺性巴氏桿菌C44-1。強毒菌(毒種的選育程序見圖3-l。 (二、弱毒菌(毒種選育弱毒菌(毒種主要用于弱毒疫苗、部分診斷制劑和抗血清的制造,其重要特征是致病力極微弱或無致病力,免疫原性優(yōu)良。獲得弱毒菌(毒種有以下幾種方法。1.利用病原自然弱毒株自然弱毒株是由自然強毒株在某些自然因素作用下發(fā)生基因突變形成的與祖代性狀(特別是致病力和抗原性不盡相同的生物株。這些自然因素包括異種非易感動物、溫度、日光、干燥等。因此,往往有意或無意地從自然界中分離、篩選和育成一些弱毒株,作為獸醫(yī)生物制品的種毒。例

13、如,新城疫病毒LaSota株和D10株是從自然雞群和鴨群中分離得到的,然后再通過克隆、挑選等途徑育成。但是,微生物的自發(fā)突變率很低,形成具有穩(wěn)定遺傳性狀毒株的過程也長,因此獲得自然弱毒株的幾率不高。2. 選擇異源毒株異源毒株來源于另一種自然宿主,與相關(guān)病原有一定的親緣關(guān)系,在分類上同屬不同種,但具有共同抗原,對相關(guān)病原的自然宿主不致病。如火雞皰疹病毒Fc126株分離于火雞,對雞無致病性,與雞馬立克氏病病毒有共同抗原,因而可用于制備疫苗預(yù)防雞馬立克氏病。3.人工致弱強毒株對天然強毒株進行毒力的人工致弱是培育弱毒菌毒種的主要方法,采用的途徑主要有物理途徑、化學途徑和生物學途徑,這些途徑可以聯(lián)合使用

14、。(1 物理途徑高溫、干燥、射線等物理因素可導致核酸的突變從而引起遺傳性狀的改變。早在1881年,巴斯德將炭疽強毒菌在42.5高溫下長期傳代培養(yǎng),育成了炭疽弱毒菌株。后來,巴斯德又將含有狂犬病病毒的腦脊髓置干燥條件中處理,獲得了狂犬病病毒弱毒株。日本乙型腦炎病毒強毒株經(jīng)紫外線照射后能引起基因突變,從而出現(xiàn)遺傳性狀分離,再進行蝕斑挑選,育成弱毒株用于制造弱毒疫苗。(2化學途徑將微生物用化學誘變劑處理,可極大地提高其基因突變率,從而獲得弱毒株。如通過亞硝基胍處理支原體己育成了雞支原體疫苗株和肺炎支原體突變株;將豬副傷寒沙門氏菌強毒株在含有1/5001/1000醋酸鉈的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳50代后,育

15、成了弱毒株。(3 生物學途徑通過生物學途徑育成的弱毒株生物穩(wěn)定性極件,是培育弱毒株的常用途徑,但育成過程比較長。具體的方法有:適應(yīng)鈍感動物(非自然宿主:通常用兔、小鼠、地鼠、豚鼠、雞、鵪鵓等實驗動物進行。其優(yōu)點是動物來源廣,飼養(yǎng)管理方便,成本低,操作便利。接種途徑多采取腹腔、靜脈或腦內(nèi)大劑量注射。我國的豬瘟兔化弱毒株,是將豬瘟病毒強毒株通過兔體傳400余代后育成的。適應(yīng)鈍感禽胚:強毒株經(jīng)鈍感的雞胚、鵝胚或鴨胚等連續(xù)傳代后,毒力可發(fā)生減弱。如,鴨瘟雞胚化弱毒株,是將鴨瘟病毒強毒株經(jīng)鴨胚傳9代和雞胚傳23代后育成的。適應(yīng)細胞:多采用同源或異源動物組織的原代細胞。如,日本的豬瘟GPE弱毒株是將豬瘟A

16、LD強毒株通過豬睪丸細胞142代和牛睪丸細胞36代傳代后,再經(jīng)豚鼠腎細胞傳41代后育成的;我國的馬傳染性貧血病驢白細胞弱毒株,是將馬傳染性貧血病驢白細胞強毒株通過驢白細胞傳代育成的。雜交減毒:是讓兩種遺傳性狀不同的毒株在傳代培育中進行自然雜交,以導致突變育成有使用價值的弱毒株。如,流行性感冒弱毒株的育成是將溫度敏感株(毒力弱,抗原性弱與流行株(毒力強,抗原性強進行混合培養(yǎng)傳代,兩者毒力基因發(fā)生交換產(chǎn)生毒力低、抗原性強的毒株。(4 基因工程途徑采用基因工程途徑構(gòu)建性狀穩(wěn)定的弱毒株制備基因缺失疫苗是疫苗研制的新途徑之一。將強毒株的致病基因切除獲得弱毒或無毒株,但保留免疫原性和感染能力,用此變異株制

17、成的活疫苗安全性好,不易返祖。如偽狂犬病病毒,去除決定其致病力的TK基因獲得偽狂犬病病毒TK突變株,用該突變株制成的疫苗是第一個商品化的基因缺失疫苗,預(yù)防偽狂犬病效果十分理想。由于微生物變異的方向難以預(yù)測,所以只能在培育過程中對各個表現(xiàn)遺傳性狀的群體按照需要進行選擇,以求篩選出目的變異株。這種選擇首先從外表觀察、檢測開始,然后再作系統(tǒng)的檢測篩選。變異株初選依據(jù)包括:細菌菌落特征的變異,如菌落大小、形狀、色澤、粗糙或光滑、熒光等;病毒蝕斑的變異,如蝕斑的有無、大小、形狀等;對溫度敏感性變異:對藥物敏感性變異;對營養(yǎng)要求變異,如對氨基酸的特殊需要;對宿主動物易感性變異。弱毒菌(毒種的選育程序見圖3

18、-2。 我國經(jīng)長期研究,育成了一些弱毒株(表3-2,作為疫苗種毒生產(chǎn)疫苗,在控制和捎滅動物疫病中發(fā)揮了重要的作用。 第二節(jié)細菌培養(yǎng)技術(shù)一、細菌的生長條件與繁殖規(guī)律(一、細菌的生長條件細菌進行生長繁殖需要合適的條件,這些條件包括營養(yǎng)、溫度、酸堿度(pH、滲壓和氣體等。1. 營養(yǎng)細菌生長所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)是水、無機鹽、碳源和氯源。某些細菌對營的要求比較高,需要添加生長因子方能正常生長。(1 水是細菌的重要組成成分,占菌細胞重量的70%90%。細菌進行正常的生命活動必須有水的參與。水是良好的溶媒,營養(yǎng)物質(zhì)只有在水溶液中才能被細菌吸收,代謝物的排出也必須依靠水性環(huán)境。水參與菌體內(nèi)一系列化學反應(yīng),

19、幫助維持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的天然構(gòu)象。水的比熱高,導熱性良好,能有效地調(diào)節(jié)菌細胞內(nèi)的溫度。(2 無機鹽是細菌生長必不可少的一類營養(yǎng)物質(zhì),提供細菌生長所需的常量元素和微量元素。無機鹽具有重要的生理功能,它們參與菌體物質(zhì)的組成,維持原生質(zhì)體的膠體狀態(tài)和滲透壓,調(diào)節(jié)酸堿度,控制氧化還原電位,有些元素是酶的激活劑或活性基團的組分。細菌生長所需要的無機鹽一般有磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、氯化物以及鈉、鉀、鈣,鎂、鐵等金屬元素的化合物。(3 碳源不僅可用于合成菌體的含碳物質(zhì),還能為細菌生長提供大量能源。自養(yǎng)菌能利用CO2碳酸鹽等無機碳源,而異養(yǎng)菌則以糖類、醇類、有機酸類等有機物作為碳源。一般來說,糖類是

20、多數(shù)異養(yǎng)菌最理想的碳源,其中單糖優(yōu)于多糖,己糖優(yōu)于戊糖,尤其是葡萄糖能被多數(shù)細菌利用,于培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖能促進細菌的物質(zhì)代謝,具有增加菌數(shù)的作用。(4 氮源主要用來合成菌體的含氮物質(zhì),一般不作為能源使用。能被細菌利用的氮源包括蛋白質(zhì)及其不同程度的降解產(chǎn)物(胨、肽、氨基酸等、銨鹽、硝酸鹽、尿素等。合成能力強的細菌既能利用有機氨源,也能利用無機氮源,合成能力弱的細菌僅能利用有機氨源。多數(shù)病原菌只有供給有機含氨源才能生長。實踐中常用的氨源物質(zhì)有蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏等。(5 生長因子是某些細菌生長所必需的而且需要量很少,但細菌自身不能合成或合成量不足以滿足需要的有機化合物。細菌需要的生長

21、因子有維生素、氨基酸、嘌呤及嘧呤三大類,主要作為酶的輔酶或輔基和合成菌體的某些組分。人工添加血液、血清、肝浸液、腹水、馬鈴薯汁和酵母浸出液等能供給細菌所需的生長因子。2. 溫度任何細菌都有其可生長的溫度范圍和最適溫度,在最適溫度下,細菌生長最快。高溫對細菌具有致死作用;低溫會使細菌的生命活動受到抑制,但條件適宜又會復蘇。病原菌能夠生長的溫度范圍是1045,最適生長溫度多為37,少數(shù)為2228。3. pHpH對細菌的生長影響很大。雖然大多數(shù)細菌在pH68之間可以生長.但多數(shù)病原菌生長的最適pH為7.27.6,霉菌生長的最適pH為56。細菌生長過程中,由于代謝產(chǎn)物的堆積會引起pH的改變,從而妨礙細

22、菌的生長。所以往往需要在培養(yǎng)基中加入一定量的緩沖劑進行調(diào)節(jié)。4. 滲透壓細菌進行生長繁殖,需要適宜的滲透壓。多數(shù)精原菌只能在等滲環(huán)境下生長繁殖,在低滲溶液中,細菌會吸水膨脹,引起菌體破裂,在高滲溶液中會發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象而死亡。由于細茼的細胞壁比較堅韌,所以對滲透壓有一定的適應(yīng)能力,少數(shù)細菌能夠耐受高滲環(huán)境,如金黃色葡萄球菌。5. 氣體與細菌生長繁殖有關(guān)的氣體主要是CO2和O2,根據(jù)細菌對O2的需求,可將其分為4種類型。(1 專性需氧菌在有氧的環(huán)境中才能生長繁殖,如結(jié)核桿菌。(2 微需氧菌如牛型布氏桿菌,生長需要少量的O2,一般為2%10%。(3兼性厭氧菌在有氧或無氧的條件下都能生長繁殖,多數(shù)細

23、菌都屬這一類型,如大腸桿菌。(4專性厭氧菌必須在無氧環(huán)境中才能生長,如破傷風梭菌。有些細菌生長時需要一定濃度的CO2,如布氏桿菌在初分離時,要在含5%l0%CO2的環(huán)境中才能生長。因此,在培養(yǎng)細菌時,應(yīng)根據(jù)細菌的特點給予合適的氣體環(huán)境。(二、細菌的繁殖規(guī)律細菌在適宜的環(huán)境中以二分裂法繁殖。將少量細菌接種到新鮮液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),在不補充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物,保持整個培養(yǎng)液體積不變的條件下,以時間為橫坐標.以菌數(shù)對數(shù)為縱坐標.根據(jù)不同培養(yǎng)時間里菌數(shù)的變化,可以作出一條反映細菌在整個培養(yǎng)時間內(nèi)菌數(shù)變化規(guī)律的曲線,稱為生長曲線。一條典型的生長曲線可以分為四個時期(圖33。 1. 遲緩期細菌接種到新

24、鮮培養(yǎng)基而處于一個新的生長環(huán)境,需要一段時間進行適應(yīng)。此時,細菌的數(shù)量基本不變,但菌體緩慢長大,為分裂繁殖做準備。在工業(yè)發(fā)酵中,遲緩期會增加生產(chǎn)周期而產(chǎn)生不利的影響。2. 對數(shù)期在這一階段,細菌數(shù)量以2n遞增(n為分裂次數(shù),繁殖的速度取決于細菌的世代時間,多數(shù)細菌繁殖一代需要2030min,有的長達10余小時。對數(shù)期的細菌代謝活性高而穩(wěn)定,大小比較一致,生活力強,因而廣泛地在生產(chǎn)上用作種子,以縮短生產(chǎn)周期。3. 穩(wěn)定期隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物積累和pH等環(huán)境變化,細菌生長速度逐漸緩慢,新增加的細菌數(shù)與死亡細菌數(shù)大致相等,活菌數(shù)相對恒定。在這一階段,細菌的芽孢和外毒素等開始產(chǎn)生。如果及時采取

25、措施,改善培養(yǎng)條件,如補充營養(yǎng)物,對需氧菌進行通氣、攪拌或振蕩等,可以延長穩(wěn)定期,獲得更多的菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物。貧瘠的生長環(huán)境已無法滿足細菌的生長需求,細菌死亡率逐漸增加,活菌數(shù)顯著下降。掌握細菌的生長規(guī)律,可以在人工培養(yǎng)細菌時,不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件,從而提高細菌或其產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。二、細菌培養(yǎng)的基本技術(shù)細菌培養(yǎng)是讓細菌在動物體外的人工培養(yǎng)基和人工控制的環(huán)境中進行生長的過程,是制造細菌性生物制品的中心環(huán)節(jié),是檢驗制品純粹與否或滅活是否完全的主要手段。(一、細菌的分離培養(yǎng)1. 一般分離方法(1 平板劃線分離法是分離細菌最常用的方法,可以采用不同的培養(yǎng)基制備平板,用接種環(huán)沾取細菌在平板表面進行劃線。

26、劃線的方法有多種(圖3-4,目的是為了將細菌作適當稀釋,獲得單個菌落,以便于根據(jù)菌落特性進行鑒別和挑選單個菌落進行純培養(yǎng),制備規(guī)模化生產(chǎn)所需要的種子。 (2 傾注平板培養(yǎng)祛適用于深層條件下生長良好的細菌的分離培養(yǎng)。先將營養(yǎng)瓊脂加熱融解,冷卻至45 50,取1215ml加入適度稀釋的菌液1ml.混勻后傾入滅菌平皿制成平板,適溫培養(yǎng)一定時間后,挑取典型菌落進行純培養(yǎng)。為了能從污染樣品中分離到所需要的細菌,有時需要對樣品進行預(yù)處理,如分離培養(yǎng)芽孢菌,可先將樣品80處理1520main,殺滅非芽孢菌,再在37增苗培養(yǎng)后用平板分離。有時也可將樣品接種易感動物,再從發(fā)病死亡動物體內(nèi)分離目的菌。2. 厭氧菌

27、的分離培養(yǎng)厭氧菌在無氧的環(huán)境中才能生長,因此必須營造無氧條件來培養(yǎng)厭氧菌。厭氧菌的培養(yǎng)可采用生物學、化學和物理學方法,實際中常結(jié)合使用。(1厭氣肉肝湯法在培養(yǎng)液中,加入動物組織塊,再加入小塊石蠟,滅菌后冷卻至室溫,然后在進行接種并培養(yǎng)。本法址利用組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)來消耗培養(yǎng)液中的氧氣,同時石蠟固封時液面可隔絕空氣中的氧氣。(2保險粉法主要利用連二亞硫酸鈉和碳酸鈉吸收空氣中的氧氣,其化學反應(yīng)式為: Na2S2O4+Na2CO3+O2-Na2SO4+NaSO3+CO2, 將劃線平板放入密閉容器中,平板上層放連二亞硫酸鈉和碳酸鈉,每1000cm3空間的用量為30g,最后將容器置于溫箱

28、中進行培養(yǎng)。(3 焦性沒食子酸法在堿性溶液中,淡棕色的焦性沒食子酸能吸收大量氧氣,變?yōu)樯钭厣慕剐詻]食子橙。每100cm3空間用焦性沒食子酸1g及10%氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液10ml。將劃線平板放入密閉容器的上層,下層放入焦性沒食子酸和堿液,37培養(yǎng)。(4硫乙醇酸鈉法此法是將還原劑硫乙醇酸鈉加入培養(yǎng)基中,去除其中的氧,促使厭氧菌的生長。培養(yǎng)基中加美藍作為指示劑,在無氧條件下,美藍被還原成無色。(5高層瓊脂法加熱熔化高層瓊脂,冷至45左右接種厭氧菌,迅速混合均勻,冷凝后37培養(yǎng),細菌在近底部生長。3. 需CO2細菌的分離培養(yǎng)通常用CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),可按需要調(diào)節(jié)箱內(nèi)CO2濃度。(二、細菌的規(guī)模

29、化培養(yǎng)細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)又稱細菌的工業(yè)發(fā)酵。在微生物工業(yè)中,發(fā)酵術(shù)語指的是任何人規(guī)模過程。為了獲取最大產(chǎn)量細菌培養(yǎng)物,除了提供合適的生長條件外,種子接種量、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)方法也非常重要。1. 種子接種量凍干保存的菌種不能直接接種到培養(yǎng)基中進行工業(yè)發(fā)酵,應(yīng)首先進行復蘇,制備成種子。種子接種量對細菌產(chǎn)量有直接影響。接種量過少,細菌牛長緩慢,影響活菌數(shù),有時甚至無菌生長;接種量過多,會將過多的代謝物帶入新培養(yǎng)基內(nèi),抑制細菌生長。種子接種量通常為培養(yǎng)菌體積的1%一2%。2.培養(yǎng)時間細菌培養(yǎng)中生命力最強的最高活菌數(shù)與細菌本身的生長規(guī)律、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間有關(guān)。最佳的培養(yǎng)時間通過預(yù)培養(yǎng)測定細菌的生長曲線后確

30、定,一般在對數(shù)后期至穩(wěn)定前期活菌數(shù)量最高,生命力最強,宜于收獲。若收獲過早,活菌數(shù)少而幼嫩;反之,細菌老化,死菌及代謝產(chǎn)物增多。3. 培養(yǎng)方法應(yīng)當根據(jù)生物制品的性質(zhì)和要求及細菌的生長特性選擇合適的培養(yǎng)方法。目前規(guī)模化培養(yǎng)方法有以下幾種。(1 固體表面培養(yǎng)法將細菌種子液均勻地接種于大扁瓶(大型克氏瓶平板表而,平放于溫室靜置培養(yǎng),待培養(yǎng)結(jié)束后傾去凝集水,收集菌苔制成細菌懸液,用于制備診斷抗原或菌苗,如炭疽芽孢苗、布氏桿菌抗原等。此法可根據(jù)需要調(diào)節(jié)細菌濃度,但產(chǎn)量受限制,且勞動強度大。(2 液體靜置培養(yǎng)法適于一般細菌性疫苗的生產(chǎn)。培養(yǎng)容器可用發(fā)酵罐,按容器的深度,裝入1/22/3體積的培養(yǎng)液,經(jīng)高壓

31、蒸汽滅菌后,冷至室溫接入種子,在適宜溫度下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)厭氧菌時,裝入培養(yǎng)基的量約為容器體積的70%,有時需要加入肝組織。以促進細菌生長。此法比較簡便,但細菌產(chǎn)量不高。(3 液體深層通氣培養(yǎng)法可加速細菌的生長繁殖,提高細菌產(chǎn)量和生產(chǎn)效率,是目前菌苗生產(chǎn)的主要方法。細菌培養(yǎng)在生物反應(yīng)器中進行,該設(shè)備能自動控制通氣量、自動磁力攪拌、自動監(jiān)測和記錄pH 或溶解氧濃度、自動消泡。除細菌培養(yǎng)外,培養(yǎng)基與氫氧化鋁佐劑消毒、細菌滅活、加佐劑配苗等相關(guān)流程均可在其中完成。此法可以密閉操作,減少了污染的可能。深層通氣培養(yǎng)時應(yīng)注意以下幾點:補充營養(yǎng)物質(zhì):根據(jù)不同細菌的營養(yǎng)要求,在培養(yǎng)過程中要適量補充營養(yǎng)物質(zhì)。如添

32、加葡萄糖以補充碳源,加蛋白胨或必需氨基酸以補充氮源等?？刂仆夤┭趿?空氣中的氧分子是以溶氧狀態(tài)被細菌利用的,所以供氧量多少與通氣量、通氣方式、攪拌裝置和攪拌速度、液體溫度以及反應(yīng)缸內(nèi)有無擋板等因素有關(guān)。通氣量過大,不能增加溶氧量,反而會增加消泡劑的用量,影響細菌的生長或產(chǎn)生毒素。同時,不同細菌在不同發(fā)育階段的需氧量也不盡相同。因此,必須預(yù)先測定,掌握規(guī)律,以獲得最佳通氣量。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH:深層通氣培養(yǎng)中pH變化迅速,應(yīng)進行調(diào)節(jié)控制.使培養(yǎng)基保持最適pH。一般在細菌處于對數(shù)期時pH下降,以后隨通氣量加大,pH上升。因此除控制通氣量外,常用加葡萄糖使pH下降。此外,也可用堿液修正使pH維持穩(wěn)定。

33、調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度:大罐培養(yǎng)通入的氣體對培養(yǎng)溫度沒有明顯影響,但是培養(yǎng)罐夾層直接用蒸汽加熱往往不穩(wěn)定,最好用自控調(diào)節(jié)的溫水循環(huán)控制溫度,使培養(yǎng)溫度變化范圍不超過1。防止污染:在培養(yǎng)過程中,應(yīng)當注意避免污染的發(fā)生。發(fā)酵罐的罐體應(yīng)當密封良好,易于滅菌;通入培養(yǎng)基的氣體必須過濾除菌;發(fā)酵罐的排氣管口也應(yīng)有消毒設(shè)備,以免污染環(huán)境。(4 透析培養(yǎng)法是指培養(yǎng)物與培養(yǎng)基之間隔一層半透膜的培養(yǎng)方法。采用的培養(yǎng)裝置為發(fā)酵透析器,該裝置把培養(yǎng)基與培養(yǎng)物分開為各自的循環(huán)系統(tǒng),中間通過透析器交換營養(yǎng)物。其優(yōu)點是:培養(yǎng)基和培養(yǎng)液可獨立控制:可以攪拌和通氣;可使用任何類型的透析膜片或濾膜:液體在透析囂中的流向和流速可以隨意控制

34、;可以將每個部分按比例縮小或放大。通過透析培養(yǎng)可獲得高濃度的純菌和高效價的毒素,極有利于制造高效力的生物制品。(5連續(xù)培養(yǎng)法是指在細菌培養(yǎng)過程中,不斷供給新的營養(yǎng),同時部分移出培養(yǎng)物,延長細菌對數(shù)期的一種方法n連續(xù)培養(yǎng)裝置(圖3-5由無菌培養(yǎng)基貯存罐、培養(yǎng)罐和菌液收集罐三部分組成。在培養(yǎng)罐中裝入一定量培養(yǎng)基后,接入種子,培養(yǎng)過程中不斷滴入新鮮培養(yǎng)基。當培養(yǎng)罐菌液超過一定水平時,便逐漸溢出并流入菌液收集罐。控制培養(yǎng)基滴入速度和容量,便可控制培養(yǎng)液的流出量,保持菌液的濃度.達到提高質(zhì)量的目的。連續(xù)培養(yǎng)法的優(yōu)點是保持培養(yǎng)液pH值、底物濃度、溶解氧濃度及代謝產(chǎn)物濃度基本恒定,適于大量生產(chǎn),生產(chǎn)率比深層

35、培養(yǎng)高數(shù)倍,在恒態(tài)下增殖的菌體比較均一,幼齡,活力強,菌苗質(zhì)量更有保證。 (三、細菌計數(shù)技術(shù)細菌性疫苗或抗原生產(chǎn)中,培養(yǎng)物含菌數(shù)是制品質(zhì)量的重要指標之一?；罹缢幕罹鷶?shù)又是確定使用劑量的依據(jù),制備滅活茼苗或跨斷抗原時,菌液濃度是配苗或標化的重要參考依據(jù)。在制品質(zhì)量檢驗中也需要作細菌計數(shù)。1. 顯微鏡直接計數(shù)法此法是利用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。計數(shù)板計數(shù)室面積為1mm2,高0.1mm,在1 mm2的面積里又被劃分成25個(或16個中格,每個中格進一步劃分成16個(或25個小格。炭疽芽孢苗的總芽孢數(shù)是用此法計算的,具體操作是將稀釋的樣品滴在計數(shù)板上,蓋上蓋玻片,用顯微鏡油鏡計數(shù)5個中格

36、內(nèi)的芽孢數(shù),再按下面公式推算出每毫升原液所含芽孢數(shù)。每毫升原液所含芽孢數(shù)=每中格平均芽孢數(shù)2510000稀釋倍數(shù)2. 比濁計數(shù)法比濁計數(shù)法是計數(shù)細菌懸液中總菌數(shù)的常用方法,原理是菌液中含菌數(shù)。菌液渾濁度成正比,即與光密度成正比。具體的方法有比濁管比濁法和分光光度計法。(1 比濁管比濁法目前有商品化標準比濁管供應(yīng),每個比濁管的濁度指示定的菌數(shù)。計數(shù)方法是,先將待檢菌液作適當稀釋,放入與標準比濁管規(guī)格一致的試管中,然后與標準比濁管進行比較,若稀釋菌液的濁度與某一標準比濁管的濁度基本相同,即按該標準比濁管指示的菌數(shù)得出待檢菌液中的細菌數(shù)。(2 分光光度計法此法借助于分光光度計,在定波長下,測定菌液的

37、光密度,以光密度(即OD值表示菌量。測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi),否則不準確。3.活菌計數(shù)法在生物制品生產(chǎn)中,常用的活菌計數(shù)法有傾注平板培養(yǎng)法、平板表面散布法和微量點板計數(shù)法。計數(shù)時,首先需要將待測樣品精確地作一系列稀釋(通常10倍遞進稀釋,然后吸取不同稀釋度的樣品接種于合適的半板進行培養(yǎng),用菌落形成單位(CFU裘示計數(shù)結(jié)果。計算公式為:每毫升待測樣中的活菌數(shù)=同一稀釋度三個以上重復平板菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)。(1 傾注平板培養(yǎng)法分別取不同稀釋度的樣品1ml加入滅菌平皿中,然后取4550的滅菌營養(yǎng)瓊脂分別傾入平皿,立即混勻,平放使其凝固成平板,37培養(yǎng)一定時間,統(tǒng)計平板上長出

38、的菌落數(shù),計算每毫升樣品中的活菌數(shù)(圖3-6。 (2 平板表面散布法按常規(guī)方法制作平板,晾干凝集水后,分別取不同稀釋度的菌液0.1m1均勻涂布在甲板表面,37烘干20min左右,然后倒置培養(yǎng),統(tǒng)計平板上張出的菌落數(shù),乘以稀釋倍數(shù),再乘以10,即為每毫升樣品中所含的活菌數(shù)。(3 微量點板計數(shù)法取各個稀釋度的樣品0.02m1分別點在晾干的平板表面,使其自然擴散,37烘干20min 后倒置培養(yǎng),統(tǒng)汁、平板上長出的菌落數(shù),乘以稀釋倍數(shù),再乘以50,即得計數(shù)結(jié)果。本法一塊平板可接種8個樣品,大大節(jié)省了培養(yǎng)基。三、培養(yǎng)基培養(yǎng)基是按照微生物的生長需求幾工配制的營養(yǎng)物質(zhì),廣泛應(yīng)用于生物制品的生產(chǎn)中。(一、培養(yǎng)

39、基的分類培養(yǎng)基種類繁多,根據(jù)其原料、物理性狀和用途可分為多種類型。1. 按原料來源分類(1天然培養(yǎng)基用天然有機營養(yǎng)物,如蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、血液等配制而成,其含有的化學成分不清楚或不恒定。這類培養(yǎng)基原料來源方便,成本較低,適用于生物制品的生產(chǎn)。(2合成培養(yǎng)基成分明確,用化學物質(zhì)和生物試劑混合制成。這類培養(yǎng)基目前已實現(xiàn)了商品化,使用方便,但成本較高。2. 按物理性狀分類(1 液體培養(yǎng)基未加任何凝固劑,在生物制品中應(yīng)用十分廣泛,是細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)的常用培養(yǎng)基。(2 半固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入0.3%0.5%瓊脂制成,常用在細菌的運動性觀察、鑒定和保種等方面。(3 固體培養(yǎng)基于液體培養(yǎng)基

40、中加入1.5%2%瓊脂或10%15%明膠制成,前者最為常見,可用于細菌分離培養(yǎng)、鑒定、生物制品生產(chǎn)等;后者多用于細菌生化特性鑒定。3. 按用途分類(1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基可作為其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液,大多數(shù)細菌都能在其中生長,在生物制品上應(yīng)用很廣。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。(2 營養(yǎng)培養(yǎng)基又稱加富培養(yǎng)基,是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì),如血液、血清、酵母浸膏、動植物組織等制成的,供一些營養(yǎng)要求比較苛刻的細菌的生長。(3 選擇培養(yǎng)基只供某些細菌生長,抑制另一些細菌生長的培養(yǎng)基,多在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種抑菌化學物質(zhì)制成;(4 鑒別培養(yǎng)基通常在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某種作用底物和指示劑制成,用于鑒

41、別不同細菌。如H2S試驗培養(yǎng)基,加有底物含硫氨基酸,指示劑為醋酸鉛,能夠區(qū)分大腸桿菌和沙門氏菌。(5 增菌培養(yǎng)基具有抑制雜菌,促進本菌生長的作用,如從污染的樣品中分離沙門氏菌所用的四磺酸鈉增菌培養(yǎng)液。(6 厭氧培養(yǎng)基用于厭氧菌的分離培養(yǎng)。(二、培養(yǎng)基的原料生產(chǎn)獸醫(yī)生物制品所用培養(yǎng)基的主要原料有水、肉浸液、蛋白胨、瓊脂、明膠、酵母浸汁和化學試劑等。1. 水制造培養(yǎng)基一般使用去離子水或蒸餾水,有時大量生產(chǎn)培養(yǎng)基時也用常水(井水、自來水或河水。常水中含有較多的無機鹽,使用前需要進行一定的處理,井水和河水需先煮沸、冷卻澄清過濾后再用,自來水需先測定殘余氯含量。去離子水是用離子交換樹脂處理,去除了陰、陽

42、離子的較為純凈的水,適于大量生產(chǎn)培養(yǎng)基使用。2. 肉浸汁是生產(chǎn)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)原料。制備肉浸汁多用牛肉,應(yīng)選用新鮮的健康牛肉。牛肉去除脂肪及筋腱后絞碎,10以下加水浸泡過夜,加熱煮沸3060min,冷卻過濾得到的淡黃色透明液體即為肉浸汁。肉浸汁含有豐富的營養(yǎng)成分,能提供細菌生長所需的碳源、氮源、無機鹽利生長因子。牛肉浸膏是肉浸汁除水濃縮后的產(chǎn)物,其營養(yǎng)價值不及肉浸汁,但使用方便。生產(chǎn)獸醫(yī)生物制品的培養(yǎng)基還常用肝浸液與胃消化湯。制備肝浸液可用豬肝、牛肝或羊肝;制備胃消化湯用豬胃。原料應(yīng)新鮮,無異味,無病變,有彈性。3. 蛋白胨蛋白胨是動植物蛋白質(zhì)經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶等水解后的產(chǎn)物,為淡黃

43、色或棕黃色粉末,易溶于水,主要為細菌生長提供氮源和碳源。蛋白胨通常與牛肉浸汁混合使用。4. 瓊脂瓊脂是從石花菜等海藻中提取的復雜多精,為半乳糖膠,在96可溶于水,45凝固。瓊脂不能被細菌分解,無毒性,高溫滅菌不被破壞,透明度好、黏附性強,配制方便且價格低廉,是制備固體培養(yǎng)基最理想的凝固劑。5. 明膠明膠是一種蛋白質(zhì),由動物膠原組織加工處理制成,由于缺乏必需氨基酸,其營養(yǎng)價值不高。明膠在2630可溶于水,20以下凝固呈半透明狀固體,由于某些細菌能分解明膠,故多用于制備鑒別培養(yǎng)基。6. 酵母浸汁酵母浸汁可補充維生素,有機氮源和生長因子,是促進細菌生長的重要原料。市售酵母浸汁為棕黃色黏稠膏狀,溶于水

44、;另有粉狀制劑,為棕黃色。7.化學試劑化學試劑的標準應(yīng)該在化學純以上。(三、培養(yǎng)基的制備程序雖然培養(yǎng)基種類很多,但制備方法卻基本一致。1. 調(diào)配按照配方準確稱取備種成分放于玻璃、搪瓷、鋁或不銹鋼容器中,但不可用銅或鐵制容器,以免金屬離子進入培養(yǎng)基,而影響細菌的生長。大量原料可用臺秤稱取,小量可用天平稱取,有的原料需要量少,不便稱取.可先配成高濃度溶液,然后按比例加入培養(yǎng)基中。原料稱好備齊后,加少量水浸透,補足水量,使原料溶解。也可用熱水或加熱進行溶解,并隨時攪拌,防止外溢。待完全溶解后再補足水量。2. 酸堿度(pH調(diào)整培養(yǎng)基的pH可用pH試紙、pH比色計或酸度計測定。用pH試紙測定酸堿度較粗略

45、,如果所培養(yǎng)的微生物對pH的要求比較嚴格,就需要用較精密的pH測定儀器進行測定和調(diào)整。由酸調(diào)堿,可用氫氧化鈉溶液或碳酸鈉溶液;由堿調(diào)酸,可用鹽酸或磷酸溶液。為防止因反復調(diào)整pH而影響培養(yǎng)基的容量,應(yīng)先取少量培養(yǎng)基,用低濃度的堿液或酸液進行調(diào)整,然后按比例調(diào)整其余培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌后其pH值降低0.10.2,故調(diào)整時應(yīng)比實際需要的pH值高0.10.2。固體培養(yǎng)基pH的調(diào)整,應(yīng)使培養(yǎng)基的溫度保持在60以上,溫度低時瓊脂黏稠甚至凝固,使調(diào)整工作無法進行。瓊脂亦可在pH調(diào)整后加入,然后加熱使其融化。3.過濾與澄清培養(yǎng)基配成后一般都有沉渣或混濁,不便于觀察微生物培養(yǎng)特征和生長情況,需過濾澄清使其清晰透明

46、才可使用。常用的過濾澄清方法如下。(1 過濾培養(yǎng)基可用紗布、脫脂棉或濾紙進行過濾。用45層紗布過濾,可去除粗的沉渣,然后再用棉花或濾紙進行過濾。用脫脂棉過濾時,可將脫脂棉夾在兩層紗布中間。液體培養(yǎng)基亦可用濾紙直接過濾。為提高過濾效果,可將濾紙在水中弄碎,使其成為濾紙漿,再在布氏(平底漏斗上鋪成濾紙版,然后用負壓抽濾。濾紙漿用后洗凈還可繼續(xù)使用。(2 澄清培養(yǎng)基混濁是因為其中含有很多膠體混懸物,這些混懸物在高溫下可聚集沉淀。利用這個特性,將制好的培養(yǎng)基置于高壓鍋內(nèi),110加熱30min,放置數(shù)小時,瓊脂培養(yǎng)基最好過夜,使培養(yǎng)基自行澄清。液體培養(yǎng)基可用膠管將上清液取出,瓊脂培養(yǎng)基從容器傾出,用刀將

47、底部沉渣切除,即得到透明的培養(yǎng)基。此外,為去除培養(yǎng)基中的混濁物,還可用雞蛋白進行澄清。每l000ml培養(yǎng)基用一個雞蛋白。先將蛋白用水稀釋,攪拌,加入培養(yǎng)基中,加熱煮沸30min,使混懸物吸附于凝固蛋白上而一起沉淀,然后吸出上清液或過濾去除混濁物。4. 滅菌培養(yǎng)基分裝、包扎完后應(yīng)進行滅菌,除特殊情況外,一般培養(yǎng)基均用高壓蒸汽滅菌。一般試管或三角燒瓶裝少量培養(yǎng)基,可用121、1520min進行滅菌處理。大容量的固體培養(yǎng)基因傳熱較慢,滅菌的時間應(yīng)適當延長。滅菌時,應(yīng)排凈滅菌器內(nèi)的冷空氣,達到預(yù)定溫度(或壓力時開始計時。有些培養(yǎng)基如糖發(fā)酵培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、氨基酸營養(yǎng)液等因不宜高壓滅菌,而用流通蒸汽進

48、行滅菌。流通蒸汽滅菌的溫度通常不超過100,對一般細菌繁殖體經(jīng)1530min 即可殺死,而對細菌芽孢常不能全部殺死,所以實踐中常用間歇滅菌法進行滅菌,即第一次流通蒸汽滅菌后,經(jīng)一晝夜進行第二次流通蒸汽滅菌,再經(jīng)一晝夜進行第三次流通蒸汽滅菌,以達到既能滅菌,又不影響培養(yǎng)基質(zhì)量的目的。某些極不耐熱的成分,如血清等,可經(jīng)濾過除菌后再加入到滅菌的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基制好后,在使用前應(yīng)做無菌檢驗。一般是將培養(yǎng)基置于37保溫2448h,證明無菌后方可應(yīng)用。滅菌過的培養(yǎng)基最好及時用完,若不能用完可放入48冰箱保存,不宜保存過久,以免營養(yǎng)價值降低,影響使用效果。第三節(jié)病毒增殖技術(shù)一、病毒的復制周期病毒是專性細胞的

49、內(nèi)寄生物,自身無完整的酶系統(tǒng),不能進行獨立的物質(zhì)代謝,必須依賴宿主細胞提供能量、原料和場所才能進行增殖,其增殖方式為核酸復制。(一、病毒增殖過程病毒的增殖過程包括吸附、侵入、脫殼、生物合成、裝配和釋放六個階段。1. 吸附病毒感染細胞,首先得吸附于細胞表面。這一過程的第一步是靜電吸引,這種吸引是非特異的、可逆的。陽離子(如鈣、鎂能降低病毒和細胞表面的負電荷,促進吸引作用。第二步是病毒與細胞表面受體進行結(jié)合,這種結(jié)合是特異的、不可逆的。不同的病毒需要的受體各異,只有在易感細胞表面才存在與病毒相匹配的受體。細胞上的受體數(shù)目估計可達10 10個。病毒吸附于細胞的過程從數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘不等,并與溫度有關(guān)

50、,一般37時吸附最好,4吸附較慢。2. 侵入侵入又稱病毒內(nèi)化,是一個依賴于能量的感染步驟。病毒侵入宿主細胞的方式有多種,有囊膜病毒可通過胞飲作用、囊膜與細胞膜的融合作用進入細胞;無包膜病毒則直接侵入細胞或經(jīng)胞飲作用進入細胞。3. 脫殼對多數(shù)病毒來講,脫殼與侵入是同時進行的。有包膜病毒的脫殼過程包括脫囊膜和脫衣殼,無包膜病毒僅有脫衣殼過程。病毒脫殼后,釋放出裸露的核酸,這是病毒基因組進行功能表達所必需的。4. 生物合成病毒核酸在細胞內(nèi)進行自身復制和指導蛋白質(zhì)的合成。在此期間,細胞內(nèi)檢測不到完整的病毒粒子。病毒脫殼后至子代病毒出現(xiàn)這段時期稱為隱蔽期。生物合成主要為mRNA的轉(zhuǎn)錄、病毒多肽的轉(zhuǎn)譯和基

51、因組的復制。不同的病毒,其核酸轉(zhuǎn)錄和復制的方式不同。5. 裝配在感染細胞內(nèi),新臺成的病毒結(jié)構(gòu)組分以一定的方式結(jié)合,組裝成完整的病毒顆粒,稱為病毒的裝配。不同的病毒,裝配部位不同。多數(shù)DNA病毒在細胞核內(nèi)裝配,而RNA 病毒在細胞漿內(nèi)裝配。6. 釋放病毒粒子的釋放方式因病毒而異。有的病毒聚積在細胞空泡內(nèi)通過細胞通道向外溢出;有的依靠細胞破裂放出。有囊膜的病毒多數(shù)借出芽釋出,同時獲得囊膜。出芽釋放病毒后,細胞膜會自動粘合,細胞不會死亡。病毒從吸附于細胞開始,到子代病毒從細胞釋放,即完成一個復制周期。不同的病毒,一個復制周期的所需時間相差甚多。一般來講DNA病毒較長,如腺病毒需48h;RNA病毒較短

52、,如小RNA病毒僅需68h。(二、病毒的生長曲線將適量的病毒接種于標準培養(yǎng)的高濃度敏感細胞,待病毒吸附后,除去未吸附的病毒,然后繼續(xù)培養(yǎng)并定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價,并以感染時間為橫坐標,病毒效價為縱坐標,繪制出病毒特征性的繁殖曲線,即一步生長曲線(圖3-7。了解不同病毒的增殖規(guī)律,獲得高滴度病毒,對制備高質(zhì)量的病毒性制品非常重要。 二、病毒增殖的基本技術(shù)病毒只有在活的宿主細胞中才能進行增殖,其培養(yǎng)方法有動物接種、雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)。(一、動物增殖病毒技術(shù)動物接種法是增殖病毒最早采用的一種方法,目前在病毒性生物制品的制備中已很少應(yīng)用。但有些病毒至今仍未找到合適的體外培養(yǎng)方法,因此必須通過接

53、種動物進行增殖,如兔病毒性出血癥病毒。此法技術(shù)簡單,而且容易獲得成功,但是對動物的要求很高,結(jié)果判定比較困難,耗費較大,此外需要有隔離畜臺、良好的飼養(yǎng)管理和消毒設(shè)備。1. 動物的選擇獸醫(yī)生物制品中用于病毒增殖培養(yǎng)的動物主要有小鼠、地鼠、豚鼠、家兔、禽類、綿羊、猜、牛和驢等。選擇動物的標準有:對病毒的易感性高,如果病毒對宿主的選擇性很強,則應(yīng)選用自然宿主,如果選擇性不強,則可用實驗室常用小動物;健康,沒有其他病原的隱性感染:體內(nèi)沒有相應(yīng)的抗體;遺傳特性相似.個體差異較小,生物學反應(yīng)比較一致。為了保證接種的成功,最好選用等級實驗動物。對外購動物,要了解當?shù)貏游锶航】?、飼養(yǎng)及免疫接種情況,接種前要經(jīng)

54、過健康觀察,以免誤用帶有病原體的動物。2. 接種途徑根據(jù)病毒的特性確定接種途徑,接種方法包括皮下接種、皮內(nèi)接種、肌肉接種、靜脈接種、腹腔接種和腦內(nèi)接種等(詳細方法見本章第四節(jié)。3. 接種后動物的飼養(yǎng)管理和收獲病毒接種后的動物應(yīng)提供良好的飼養(yǎng)條件,嚴格按要求隔離飼養(yǎng),接種不同病毒的動物,對照動物與接種動物均應(yīng)分開飼養(yǎng)。應(yīng)逐日觀察動物的反應(yīng),選出癥候符合要求的動物,按規(guī)定采集含毒量高的組織臟器,經(jīng)檢查合格后即可使用。(二、禽胚增殖病毒技術(shù)禽胚培養(yǎng)法應(yīng)用于20世紀30年代,同前仍被廣泛地用于病毒的分離鑒定和獸醫(yī)生物制品的生產(chǎn)。幾乎所有的禽源病毒都能在禽胚中增殖,某些哺乳動物的病毒也能適應(yīng)禽胚。此法優(yōu)

55、點是禽胚來源充沛、價格低廉、可以實現(xiàn)規(guī)?；蜋C械化操作。禽胚中應(yīng)用最多的是雞胚,有時也用鴨胚、鵝胚等。1. 禽胚的選擇培養(yǎng)病毒最理想的禽胚為SPF胚,由于SPF禽類飼養(yǎng)條件嚴格,價格昂貴,商品化種蛋供不應(yīng)求,故常用非免疫胚加以補充,這種胚應(yīng)無接種病毒的母源抗體。普通胚因可能帶有多種病原體,故不適用于疫苗生產(chǎn)。此外,不同病毒對禽胚的適應(yīng)性也不同,如減蛋綜合征病毒在鴨胚中比雞胚中更易增殖,雞傳統(tǒng)性喉氣管炎病毒只能在雞和火雞胚內(nèi)增殖,因此,應(yīng)選擇對相應(yīng)病毒敏感的禽胚。蛋殼最好為白色,便于觀察。2. 接種途徑在獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中,常用的接種途徑有四種,即絨毛尿囊膜接種、尿囊腔接種、卵黃囊接種和羊膜腔接

56、種(圖38,應(yīng)當根據(jù)不同的病毒和不同的目的采用適宜的接種途徑。 (1 絨毛尿囊膜接種多用于嗜皮膚性病毒,如痘病毒、皰疹病毒等的增殖,在絨毛尿囊膜上可形成肉眼可見的痘斑。具體方法有兩種:人工氣室部接種:選擇1013日齡雞胚,劃出氣室邊界,在胚胎部位避開血管作標記,用碘酒和酒精消毒后在氣室部位鉆小孔,標記處鉆一小孔,勿穿透絨毛尿囊膜,然后用橡皮吸球緊貼氣室孔輕輕吸氣,使胚胎小孔處的絨毛膜下陷造成人工氣室,隨后注入0.l0.2ml病毒液,最后用石蠟封口,置37左右孵化。氣室部接種:選擇1013日齡雞胚.劃出氣室邊界,消毒后于氣室部位距分界線3 5mm處打一小孔(比注射針頭略大,然后用細針頭斜向蛋殼面

57、插入約5mm再退出,于氣室內(nèi)注入病毒液,用石蠟封口后置37左右孵化。(2 尿囊腔接種在獸醫(yī)生物制品上應(yīng)用最廣。通常選911日齡雞胚,劃出氣室邊界,在胚胎部位避開血管作標記,消毒后在標記處鉆一小孔,勿損傷殼膜,注入病毒0.10.2ml,封口孵化。(3 卵黃囊接種通常用58日齡雞胚,劃出氣室和胎位,在氣室中心鉆一小孔,垂直插入針頭約3mm 注入0.10.2ml病毒液后封口孵化。(4 羊膜腔接種取1012日齡雞胚,劃出氣室和胚胎位置,在氣室端靠近胚胎側(cè)的蛋殼上鉆孔,在照蛋燈下將注射器針頭輕輕刺向胚體,當稍感抵抗時即可注入病毒液0.10.2m1。也可將注射器針頭刺向胚體后,用針頭輕輕撥動,如能看到胚體隨著運動,則說明針頭已進入羊膜腔.然后再注射病毒液,最后封口孵化。3.接種后