中藥藥理作業(yè)

1、中藥青蒿素抗腫瘤藥理作用進(jìn)行文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)李曉 張恩戶摘要：目的 對(duì)青蒿素抗腫瘤藥理作用及機(jī)制進(jìn)行文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)。方法 查閱、歸納、整理2012年以前公開發(fā)表的有關(guān)青蒿素抗腫瘤的研究文獻(xiàn)，根據(jù)藥物藥理作用的評(píng)價(jià)原則和評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)青蒿素抗腫瘤藥理作用進(jìn)行文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)，以明確其治療腫瘤作用。結(jié)果：青蒿素體外抗腫瘤藥理作用確切，體內(nèi)抗腫瘤作用不確切，且作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 關(guān)鍵詞 青蒿素 腫瘤 文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)新世紀(jì)全國(guó)高等中醫(yī)院校規(guī)劃中藥藥理學(xué)專論（人民衛(wèi)生出版社，2009年）收載的中藥青蒿素有抗瘧原蟲、抗炎及免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌等作用。為此，我們以該教材中青蒿素抗腫瘤作用為研究對(duì)象，通過(guò)文獻(xiàn)查閱、歸納

2、、整理，并根據(jù)青蒿素抗腫瘤作用的評(píng)價(jià)原則，進(jìn)行文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)，以明確其抗腫瘤的藥理作用及作用機(jī)制1. 腫瘤與抗腫瘤藥理作用的評(píng)價(jià)1.1腫瘤的涵義： 腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在不同致癌因素長(zhǎng)期作用下，在基因水平上失去了對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控而致的克隆性異常，所形成的新生物。腫瘤在本質(zhì)上表現(xiàn)為細(xì)胞失去控制的異常生長(zhǎng)，這種異常生長(zhǎng)的能力除了表現(xiàn)腫瘤本身持續(xù)生長(zhǎng)外，在惡性腫瘤還表現(xiàn)為對(duì)鄰近正常組織的侵犯及經(jīng)血管、淋巴管和體腔轉(zhuǎn)移到身體其他部位，這往往是不能徹底治愈和致死亡的主要原因。目前已基本明確腫瘤的發(fā)病機(jī)制有：（1）腫瘤細(xì)胞的基本特征是細(xì)胞生長(zhǎng)失控和分化受阻其去分化的一個(gè)重要特征就是 G1-S期卡點(diǎn)失常進(jìn)入S期的細(xì)

3、胞異常增多（2）腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移依賴血管生成 許多與血管關(guān)系密切的腫瘤可以自分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，提高血管通透性，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移最終導(dǎo)致腫瘤血管生長(zhǎng) （3）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是多種腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，腫瘤可以誘導(dǎo)淋巴管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)新生的淋巴管向區(qū)域（4）與正常細(xì)胞相比，大部分癌細(xì)胞鐵吸收率較高 ，因?yàn)榘┘?xì)胞分裂時(shí)需要大量鐵質(zhì)才能復(fù)制染色體，且癌細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量顯著高于正常細(xì)胞 1.2抗腫瘤的評(píng)價(jià)方法：腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在基因水平上失去了對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控而致的克隆性異常，所形成的新生物，主要病因是機(jī)體內(nèi)外不同致癌因素，對(duì)于抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究主要是建立動(dòng)物移植性腫瘤模型及體外瘤

4、細(xì)胞培養(yǎng)，利用以下實(shí)驗(yàn)方法觀察瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)學(xué)及的動(dòng)態(tài)變化。1動(dòng)物移植性腫瘤模型 觀察計(jì)算，流細(xì)胞儀測(cè)定，酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測(cè)定2. MTT法3. DNA電泳及NBT還原試驗(yàn)方法4. 集落形成法 5. 選用臨床使用的放療源如60Co或X光，與中藥合用，及選用烷化劑、代謝拮抗劑或抗腫瘤抗菌素等有代表性的抗腫瘤藥，與中藥合用6. 人體腫瘤裸鼠異種移植模型采用相對(duì)腫瘤體積的腫瘤增殖速率(T/C%)等方法7. 其他：影響荷瘤動(dòng)物免疫功能及腫瘤抑制試驗(yàn)2.再評(píng)價(jià)方法2.1文獻(xiàn)收集：查閱有關(guān)實(shí)驗(yàn)性研究文獻(xiàn)，其中，1979年以前的查閱中藥研究文獻(xiàn)摘要（劉壽山主編，科學(xué)出

5、版社 18201984），19792012年間的文獻(xiàn)以中國(guó)知網(wǎng)http:/ 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)為主，其他數(shù)據(jù)庫(kù)為輔進(jìn)行檢索，查閱。2.2文獻(xiàn)整理：制作中藥青蒿素抗腫瘤的藥理作用文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)信息表,內(nèi)容包括供試藥或儀器準(zhǔn)備，給藥方法或試驗(yàn)用藥法，細(xì)胞株和（或）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)方法，陽(yáng)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論，作者及工作單位，刊物發(fā)表年代。研讀文獻(xiàn)，摘錄相關(guān)信息并填入表格，進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表。青蒿素抗腫瘤的藥理作用研究文獻(xiàn)一覽表實(shí)驗(yàn)方法衡量指標(biāo) 衡量指標(biāo)文獻(xiàn)篇數(shù)建立動(dòng)物移植性腫瘤模型觀察計(jì)算腹水型EAC小鼠生命小鼠生命延長(zhǎng)率1移植瘤抑瘤率2流式細(xì)胞儀測(cè)定移植瘤抑瘤率瘤細(xì)胞凋亡率1酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測(cè)

6、定Caspase-3活性Caspase-3活性2體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)增殖抑制作用細(xì)胞活力2透射電鏡或熒光鏡觀察凋亡小體4流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率4端粒酶活性1MTT比色法瘤細(xì)胞的毒性1瘤細(xì)胞抑瘤率9IC503細(xì)胞數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法生長(zhǎng)抑制曲線2流式細(xì)胞技術(shù)MCF-7/ ADR細(xì)胞P-糖蛋白1熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位細(xì)胞線粒體跨膜電位1Wesen-botting 檢測(cè)線粒體細(xì)胞漿細(xì)胞色素 C的表達(dá)細(xì)胞色素 C蛋白條帶1單細(xì)胞凝膠電泳( SCGE)細(xì)胞核DNA的損傷細(xì)胞核DNA1誘導(dǎo)分化細(xì)胞分化1transwell小室法和沖刷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的侵襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力12.3青蒿素抗腫瘤的評(píng)定

7、方法：評(píng)價(jià)青蒿素抗腫瘤的藥理作用主要是通過(guò)動(dòng)物移植性腫瘤模型觀察計(jì)算移植瘤抑瘤率、瘤細(xì)胞凋亡率；體外瘤細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)測(cè)細(xì)胞活力及MTT比色法檢測(cè)瘤細(xì)胞抑瘤率和IC50，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率和端粒酶活性，因此可將瘤細(xì)胞抑瘤率和IC50、細(xì)胞凋亡率、移植瘤抑瘤率相關(guān)性分析作為重要的量化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)研究，且實(shí)驗(yàn)方法較多；線粒體參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展及調(diào)控過(guò)程，細(xì)胞線粒體跨膜電位下降及端粒酶活性降低，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞線粒體跨膜電位、端粒酶活性也可作為一個(gè)指標(biāo)。此外，通過(guò)抑制谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶的活性可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的多藥抗性，聯(lián)合轉(zhuǎn)鐵蛋白可以逆轉(zhuǎn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的多藥耐

8、藥性，與吡柔比星多柔比星等抗腫瘤藥物具有協(xié)同抗腫瘤作用；輻射增敏作用檢測(cè)也是一種重要的方法。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行分子學(xué)研究，觀察DNA也是一個(gè)指標(biāo)。由于青蒿素藥理作用復(fù)雜，藥理作用間也會(huì)相互影響，一兩種方法可能出現(xiàn)偏差，所以中藥藥理作用的評(píng)價(jià)應(yīng)符合綜合評(píng)價(jià)和重復(fù)性等原則。根據(jù)上述原則，確定評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：采用3種以上上述實(shí)驗(yàn)方法，且每種實(shí)驗(yàn)方法不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均有效。對(duì)于每一種實(shí)體型動(dòng)物移植性腫瘤模型，推薦采用瘤重的腫瘤抑制率（%）作為試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通常為抑制率（%）50 %，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P < 0.05為有效。針對(duì)每一種人體腫瘤異體移植瘤模型，推薦采用相對(duì)腫瘤增殖率T/C（%）

9、作為試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通常為：T/C（%）>50 %為無(wú)效；T/C（%） 50%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P < 0.05為有效。在體內(nèi)有效性試驗(yàn)采用的全部人體腫瘤異體移植瘤模型中，一般至少應(yīng)有2種達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)，才提示藥物有必要進(jìn)入臨床試驗(yàn)。在評(píng)價(jià)時(shí)還尤其應(yīng)關(guān)注受試物與陽(yáng)性對(duì)照藥試驗(yàn)結(jié)果的比較。在毒性相當(dāng)（在有效性研究中主要表現(xiàn)為動(dòng)物死亡率和體重下降相當(dāng)）的情況下，對(duì)受試物治療組和陽(yáng)性對(duì)照藥組腫瘤增殖率的比較也是評(píng)價(jià)受試物是否有必要進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重要指標(biāo)之一。體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)，MTT法測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷或抑制作用，計(jì)算受試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算半數(shù)殺傷或抑制濃度IC

10、50。3.結(jié)果 根據(jù)青蒿素抗腫瘤藥理作用研究文獻(xiàn)一覽表表明：建立動(dòng)物移植性腫瘤模型后，觀察計(jì)算移植瘤抑瘤率2篇、小鼠生命延長(zhǎng)率1篇，流式細(xì)胞儀測(cè)定瘤細(xì)胞凋亡率1篇，酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測(cè)定Caspase-3活性2篇；體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)，細(xì)胞活力2篇，MTT法測(cè)定中，瘤細(xì)胞抑制率9篇，瘤細(xì)胞的毒性1篇，IC50 3篇。透射電鏡或熒光鏡觀察，凋亡小體4篇，流式細(xì)胞儀測(cè)定中，細(xì)胞凋亡率4篇，端粒酶活性1篇，細(xì)胞數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法，生長(zhǎng)抑制曲線2篇，流式細(xì)胞技術(shù)，MCF-7/ ADR細(xì)胞P-糖蛋白、熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞線粒體跨膜電位、Wesen-botting 檢測(cè)，細(xì)胞色素 C蛋白

11、條帶、單細(xì)胞凝電泳( SCGE)，細(xì)胞核DNA、誘導(dǎo)分化，細(xì)胞分化及transwell小室法和沖刷實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞的襲、黏附和趨化運(yùn)動(dòng)能力各1篇。其中2篇建立動(dòng)物移植性腫瘤模型，包括肉瘤S180、癌細(xì)胞株小鼠移植性腫瘤模型和人胃癌細(xì)胞株SGC-790裸鼠移植瘤模型， 14篇采用體外瘤細(xì)胞培養(yǎng)，說(shuō)明青蒿素具有一定體外抗腫瘤藥理作用，但體內(nèi)抗腫瘤藥理作用不確切。4.討論很多原因引起的惡性腫瘤，理化因素及基因因素明顯，從已有文獻(xiàn)來(lái)看，體外瘤細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)測(cè)細(xì)胞活力及MTT比色法檢測(cè)瘤細(xì)胞抑瘤率和IC50，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率比較集中，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)方法主要基于體外瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的研究，通過(guò)動(dòng)物

12、移植性腫瘤模型研究藥物的抗腫瘤機(jī)制，但缺乏實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。因此有必要規(guī)范青蒿素抗腫瘤的藥理作用評(píng)價(jià)方法，如實(shí)驗(yàn)方法、重復(fù)次數(shù)等。確定青蒿素抗腫瘤藥理作用的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為：a.動(dòng)物移植性腫瘤模型：應(yīng)采用觀察、計(jì)算法計(jì)算小鼠生命延長(zhǎng)率，進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算移植瘤抑瘤率，需進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定瘤細(xì)胞凋亡率，需進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)；應(yīng)用酶標(biāo)儀Caspase-3活性的測(cè)定，進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每種采用3種以上上述實(shí)驗(yàn)方法，且每種實(shí)驗(yàn)方法不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)次數(shù)不夠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠生命延長(zhǎng)率明確，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外瘤細(xì)胞：采用臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)測(cè)細(xì)胞活力

13、進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，MTT比色法檢測(cè)瘤細(xì)胞抑瘤率進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)及IC50進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率進(jìn)行不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每種采用3種以上上述實(shí)驗(yàn)方法，且每種實(shí)驗(yàn)方法不少于2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均有效。按照此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中藥藥理學(xué)教材收載的青蒿素抗腫瘤藥理作用進(jìn)行文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)結(jié)果表明，青蒿素有體外抗腫瘤藥理作用，但體內(nèi)抗腫瘤藥理作用及藥理機(jī)制不明確。腫瘤是機(jī)體細(xì)胞在不同致癌因素長(zhǎng)期作用下，在基因水平上失去了對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控而致的克隆性異常所形成。近年來(lái),關(guān)于青蒿素抗腫瘤的作用機(jī)制研究十分活躍,綜述如下：1抑制細(xì)胞增殖 腫瘤組織生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞分裂增生旺盛，抑制腫瘤細(xì)胞的分

14、裂增生，將其阻斷在某個(gè)或者某幾個(gè)細(xì)胞周期，是多數(shù)抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)青蒿有效成分可作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖另外；2.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的一項(xiàng)重要機(jī)理，細(xì)胞凋亡是嚴(yán)格基因控制的細(xì)胞自主死亡過(guò)程的，研究表明參與細(xì)胞凋亡的途徑主要有3種：線粒體通路基因調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，細(xì)胞凋亡作用線粒體途徑：線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，它不僅為細(xì)胞生活提供充足的能力，而且可作為細(xì)胞凋亡發(fā)生的感受器和放大器，對(duì)細(xì)胞存活起重要調(diào)控作用;凋亡基因調(diào)控途徑： 家族蛋白線粒體，其成員與蛋白的比值決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡 基因是惡性腫瘤最為重要的拮抗亡基因，而在 則情況相反， 高表達(dá)時(shí)，則凋

15、亡指數(shù)高， 低表達(dá)或不表達(dá)時(shí)凋亡指數(shù)低;3.通過(guò)鐵離子介導(dǎo)而形成內(nèi)過(guò)氧化橋 ，并產(chǎn)生活性氧離子（ROS ）和以碳為核心的自由基，后者使細(xì)胞發(fā)生分子損傷和細(xì)胞死亡，與細(xì)胞內(nèi)鐵離子的結(jié)合，使其過(guò)氧橋斷裂，進(jìn)而釋放大量自由基破壞癌細(xì)胞細(xì)胞膜，癌細(xì)胞則因大量胞漿外流而死亡 ；4.抗血管生成，抗腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)是抗腫瘤新生血管生成血管生成的中心環(huán)節(jié)是血管內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生遷移分裂和分化，隨后形成管腔結(jié)構(gòu)腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，共同調(diào)控的結(jié)果，還有其他一些與抗腫瘤效應(yīng)相關(guān)的作用，例如調(diào)節(jié)免疫 增加放化療敏感性等作用;5.逆轉(zhuǎn)多藥耐藥 多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物耐藥的

16、同時(shí)，對(duì)其他許多結(jié)構(gòu)各異的抗腫瘤藥物亦產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象多藥耐藥是臨床上腫瘤化療失敗的主要原因青蒿素與傳統(tǒng)腫瘤化療藥物的作用機(jī)制不同，與其不存在交叉耐藥，并且可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，這些資料為青篙素類藥物有可能成為具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗癌新藥，但對(duì)其作用機(jī)制和抗腫瘤活性作用仍需進(jìn)行深人的研究。 主要參考文獻(xiàn)1 余和平、崔 樂(lè)等 青蒿素對(duì)乳腺癌多藥耐藥MCF_7_ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用第40卷第1期第91頁(yè)2011年2月 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2 曾靜、曹建平 青蒿素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版2009年29卷2期3 宮曉梅、周道安 青蒿素對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的毒性和放射增敏

17、研究 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)2010; 30(2)4 路景濤、 魏 偉 青蒿素抗腫瘤作用的初步研究 安徽醫(yī)藥2007January; 11(1)5 牛高華、尚凡晶等 青蒿素對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制的研究中華腫瘤雜志2010年6月第17卷第12期6 郭曉姝、張翠英 青蒿素對(duì)BGC-823癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移及侵襲能力的影響 第22卷 第5期2008年 10月 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)7 薄 劍、王全順等 青蒿素對(duì)人白血病U937細(xì)胞凋亡及分化的影響 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)( JFourthMilMedUniv) 2008, 29( 7)8 謝紅, 陳立軍 青蒿素對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的損傷作用 黑龍江醫(yī)藥科學(xué)2008年10月第31卷第5期9 董海鷹、宋維華 青蒿素誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡研究 中國(guó)腫瘤 2003年第 12卷第8 期10 謝 紅 姚 麗 青蒿素誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞K562凋亡的線粒體機(jī)制 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2009Vol.9No.411 董戩、賀強(qiáng) 青蒿素體外抑制膽囊癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用的研究 中國(guó)醫(yī)療前沿 2010年12月