變性梯度凝膠電泳及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、變性梯度凝膠電泳及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用        【關(guān)鍵詞】變性梯度凝膠電泳；法醫(yī)學(xué)應(yīng)用【中圖分類號(hào)】r9192【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】b【文章編號(hào)】10079297(2005)02006304隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和迅速發(fā)展人類基因的神秘面紗已逐步揭開(kāi)，越來(lái)越多的疾病或基因多樣性均與基因的突變有關(guān)。因此，對(duì)基因突變的篩選或診斷無(wú)論對(duì)基礎(chǔ)研究還是臨床研究均具有重要意義。近年來(lái)，一系列新的基因突變檢測(cè)方法層出不窮的同時(shí)，經(jīng)典的方法也不斷得到改進(jìn)。其中。由fischer和lerman ，2】創(chuàng)立的變性梯度凝膠電泳(denat

2、uring gradient gel electrophoresis，dgge)歷經(jīng)多次改良，已發(fā)展成一類極具實(shí)用價(jià)值的常規(guī)突變檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷或相關(guān)基因的篩查、人類基因多態(tài)性分析、微生物種群研究等各個(gè)領(lǐng)域。一、dgge基本原理dgge是利用dna的物理性質(zhì)進(jìn)行突變分析的。其原理是基于待測(cè)dna 片段雙螺旋的解鏈溫度(melting temperature。tm)。tm值由dna片段的堿基數(shù)目和堿基組成共同決定。主要引起低溫解鏈區(qū)域解鏈。當(dāng)dna片段在變性劑(尿素和甲酰胺)濃度呈線性梯度增加的凝膠中電泳時(shí)。起初雙螺旋dna片段以恒定的速率(由分子量決定)向前遷移，在抵達(dá)變性效果相

3、當(dāng)于其tm值的變性劑濃度點(diǎn)時(shí)雙鏈dna開(kāi)始部分解鏈部分解鏈后的dna分子呈分枝狀使其遷移速度極度減緩幾乎處于“停頓”狀態(tài)。長(zhǎng)度相同但序列不同的dna片段。即使僅存在單個(gè)堿基改變。也將影響鄰近堿基間的相互作用導(dǎo)致tm值的改變從而在不同的變性劑濃度點(diǎn)解鏈、“停頓”這樣dna片段由于相同電泳時(shí)間內(nèi)的不同位移而得以分離。上述原理僅能檢測(cè)dna片段中低溫解鏈區(qū)存在的序列差異或突變而位于高溫解鏈區(qū)的則無(wú)法檢出因高溫解鏈區(qū)解鏈的變性條件可使整個(gè)雙鏈完全解開(kāi)導(dǎo)致序列依賴的凝膠遷移特性喪失?；诖丝赏ㄟ^(guò)克隆或pcr方法在待檢目的片段的5 端引入3o 5o個(gè)gc堿基組成的寡核苷酸鏈 即gcclamp。使其成為片段

4、中tm最高的區(qū)域，從而使目的片段高溫解鏈區(qū)解鏈時(shí)dna雙螺旋不至于完全解鏈成單鏈，極大增加dgge的突變檢出率。3變性梯度凝膠是有方向性的，據(jù)此可將dgge分為兩類：垂直dgge和平行dgge。垂直dgge的變性劑梯度方向與電泳方向垂直，可用于確定同一dna片段上不同的解鏈區(qū)域、優(yōu)化樣本的分離條件或分析pcr產(chǎn)物的組成；平行dgge的變性劑梯度方向與電泳方向一致，在所檢測(cè)的dna解鏈區(qū)域和溫度已知的情況下可用于多個(gè)樣本的同時(shí)分析。二、dgge衍生技術(shù)圈i t 曩(一)恒定變性凝膠電泳(constant denaturant gelelectrophoresis，cdge)由hovig等嗍(19

5、91年)在dgge的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)它是通過(guò)預(yù)試驗(yàn)或理論計(jì)算預(yù)先精確確定待測(cè)dna片段的tm值后即采用相當(dāng)于該tm值的單一變性劑濃度的凝膠電泳使不同的dna片段各自以不同但恒定的速度遷移。cdge避免了化學(xué)變性劑梯度的應(yīng)用且選擇特定的最佳變性劑濃度可獲得最好的分辨效果。同時(shí)克服了dgge電泳時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，使其變得更加簡(jiǎn)單快速。但對(duì)含有多個(gè)解鏈區(qū)域的目的片段需選擇不同濃度的變性凝膠以提高檢測(cè)效率。因需事先精確確定待測(cè)片段的tm值。故該法主要用于已知突變的檢測(cè)?！净痦?xiàng)目l 國(guó)家自然科學(xué)基金資助(no30300399)【作者簡(jiǎn)介l 黃代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要從事法醫(yī)分子

6、遺傳學(xué)研究。· 146 ·(二)溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gelelectrophoresis，tgge)tgge凝膠中含有固定濃度的化學(xué)變性劑，在電泳過(guò)程中通過(guò)微處理器控制從凝膠的頂端到底端形成一線性增加的溫度梯度，以此取代dgge中的化學(xué)變性劑濃度梯度。變性環(huán)境由凝膠中恒定濃度的變性劑和溫度梯度共同構(gòu)成。5,61由于無(wú)需制備變性梯度膠，tgge較dgge更加簡(jiǎn)單穩(wěn)定。但目前大多tgge儀器所允許的溫度范圍為1580 ，較大片段的tm值會(huì)因接         

7、近8o從而增加了檢測(cè)的困難。(三)瞬時(shí)溫度梯度凝膠電泳(temporal temperature gradient gel electrophoresis，ttge)由日本學(xué)者yoshino等同于1991年建立最初稱為溫度掠掃凝膠電泳(temperature sweep gel electrophoresis，tsge)，后改稱為tyge。其原理類似于tgge，是在加有一定濃度化學(xué)變性劑的聚丙烯酰胺凝膠電泳過(guò)程中，使凝膠板的溫度以恒定速度逐漸升高，從而在跑膠的過(guò)程中形成一個(gè)溫度梯度，這樣整個(gè)凝膠中任何位置的溫度在任何特定的時(shí)間點(diǎn)都是相同的，但隨著時(shí)間的改變而變化。凝膠的溫度條件可用相關(guān)軟件(如

8、macmelt、winmelt軟件等)從相應(yīng)序列的理論解鏈曲線獲得，而無(wú)需通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)摸索。fge無(wú)需制備變性梯度凝膠，隨時(shí)間而調(diào)整溫度也較tgge更易操作同時(shí)在不降低靈敏度的前提下其分離范圍更寬，可檢測(cè)長(zhǎng)達(dá)lkb的片段。尤其是通過(guò)調(diào)節(jié)溫度范圍(窄或?qū)?及升溫速度可以很靈活地調(diào)節(jié)tyge的分離范圍81。三、dgge的主要技術(shù)特點(diǎn)作為常規(guī)突變檢測(cè)技術(shù)dgge具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)高檢測(cè)率和靈敏度。對(duì)幾百bp長(zhǎng)的dna片段，使用帶gcclamp的pcrdgge技術(shù) 突變檢出率接近100。在tgge中，一般2ram可對(duì)應(yīng)06溫差，而在tige中每小時(shí)升溫可控制為01 極小的tm值差異也可被檢出，尤其適

9、用于單堿基突變個(gè)體的篩查。在含量方面，dgge的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1。(2)檢測(cè)片段長(zhǎng)，可達(dá)1 kb。但其最適分離范圍為100500 bp，隨著片段長(zhǎng)度增加其檢出率相應(yīng)降低。(3)簡(jiǎn)單快速。主要電泳條件均由微處理器控制。如用biorad公司的dcode突變檢測(cè)系統(tǒng)最快可在2小時(shí)內(nèi)檢測(cè)64個(gè)樣品。(4)可從凝膠中分離回收片段直接用于測(cè)序。當(dāng)然該技術(shù)也存在一些不足之處：(1)實(shí)驗(yàn)之初需進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析或預(yù)試驗(yàn)以確定最佳的分離條件。(2)使用帶gcclamp的引物增加了實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。(3)gc含量較高的片段用dgge不易分析。(4)制備精確的梯度凝膠需法律與醫(yī)學(xué)雜志2005年第12卷(第2期)要熟練的操作技巧

10、及復(fù)雜的儀器設(shè)備。(5)僅能檢測(cè)突變的存在但不能確定突變類型，需進(jìn)一步測(cè)序確定。四、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用(一)在法醫(yī)dna 分型中的應(yīng)用dgge及相關(guān)衍生技術(shù)高效率的突變檢測(cè)能力使其在法醫(yī)dna多態(tài)性分型中具有極大的應(yīng)用潛能。1991年。burmeister等91采用類似rflp的基因組dgge(genomic dgge，gdgge)技術(shù)分析人類21號(hào)染色體長(zhǎng)臂近側(cè)區(qū)的序列多態(tài)性取得良好的效果。與rflp不同的是， 即使限制性內(nèi)切酶消化后片段長(zhǎng)度相同的消化產(chǎn)物gdgge也能分離。在蛋白遺傳標(biāo)記的基因分型方面，1991年，johnson等【 ol用dgge技術(shù)成功檢測(cè)出人類f一1一抗胰蛋白酶基因的所有主要

11、等位基因(m1ala、m1val、m2、m3、s和z)以及存在于內(nèi)含子3和4中的大量遺傳多態(tài)性。次年，johnson等【l】1又用pcrdgge技術(shù)嘗試對(duì)abo血型進(jìn)行基因分型一次擴(kuò)增即可成功檢測(cè)6種主要基因型，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了未曾報(bào)道過(guò)的o和b等位基因中包含的序列多態(tài)性，在95個(gè)無(wú)關(guān)歐洲個(gè)體中共檢出4個(gè)不同的o等位基因和2個(gè)不同的b等位基因，從而使該系統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值大為提高。takahashi等【 21(1991年)在分析日本人群人類f-球蛋白基因5 側(cè)翼區(qū)a 兀rr串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性時(shí)以rna ：dna形成異源雙鏈方式采用dgge技術(shù)，除成功檢出已報(bào)道的重復(fù)次數(shù)為5和6的兩個(gè)等位基因外還檢出了

12、重復(fù)次數(shù)為7和第5個(gè)重復(fù)單位中形成ag替換的2個(gè)新等位基因。chen等【 31(1994年)用tgge技術(shù)對(duì)hladrb3第二外顯子271bp的擴(kuò)增片段采用35 7o 的溫度梯度進(jìn)行分析 在hladrb3的4個(gè)等位基因drb3*0101、"0201、*0202和"0301中可成功檢出3個(gè)同源雙鏈片段其中"0201和*0202因具有相同的熱穩(wěn)定性無(wú)法區(qū)分，但可通過(guò)人工形成異源雙鏈的方法加以區(qū)分證實(shí)了tgge技術(shù)是檢測(cè)hla基因型的有效手段。steers等【 (1996年)用pcrdgge技術(shù)通過(guò)擴(kuò)增分析rhd和rhce基因的第2、第5外顯子成功地從基因組dna實(shí)現(xiàn)了

13、rh表型分型。日本學(xué)者matsuzakitakada和mukaidat 5】通過(guò)精心設(shè)計(jì)引物和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件采用pcrdgge技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在同一凝膠板上同時(shí)進(jìn)行紅細(xì)胞血型mn、dufy和kidd以及血清型gc的基因型分型。mtdna多態(tài)性多表現(xiàn)為不同核苷酸的替換，故pcrdgge這種靈敏高效的突變篩選技術(shù)非常適于mtdna的突變篩選或檢測(cè)對(duì)此已有較多的研究報(bào)道r 7j。利用dgge技術(shù)進(jìn)行mtdna分析不僅可以同時(shí)法律與醫(yī)學(xué)雜志2005年第l2卷(第2期)進(jìn)行多個(gè)樣本的檢測(cè)比對(duì)而且還可應(yīng)用于mtdna異質(zhì)性分析。1999年，steighner等181在評(píng)估pcrdgge技術(shù)檢測(cè)mtdna高變區(qū)l(

14、hv1)序列多態(tài)性的可靠性時(shí)，所有設(shè)計(jì)的49對(duì)配對(duì)序列(每對(duì)僅存在1個(gè)堿基差異)用該技術(shù)可全部有效加以區(qū)分。次年該研究小組又用dgge技術(shù)對(duì)253個(gè)隨機(jī)個(gè)體的mtdna hv1進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)35個(gè)個(gè)體存在異質(zhì)性，其中33個(gè)為單核苷酸異質(zhì)，2個(gè)為二核苷酸異質(zhì)，進(jìn)一步證實(shí)了mtdna異質(zhì)性存在的普遍性，而且該技術(shù)檢測(cè)異質(zhì)性的靈敏度高達(dá)1o19。(二)在法醫(yī)病理學(xué)研究中的應(yīng)用法醫(yī)病理學(xué)中dgge技術(shù)的應(yīng)用相對(duì)較少。1999年，opdal等 用pcrti'ge技術(shù)對(duì)158例嬰幼兒猝死綜合征(sids)和97例正常對(duì)照的mtdna 32303330nt區(qū)域進(jìn)行分析從4例sids中檢出3個(gè)不同的

15、點(diǎn)突變(t3290c、t3308c和t3308g)而對(duì)照組未檢出同時(shí)發(fā)現(xiàn)這4例sids的mtdna d一環(huán)區(qū)堿基替換率較高，提示mtdna的突變?cè)诓糠謘ids中起作用。nobel等 用pcrdgge技術(shù)對(duì)藍(lán)藻和硅藻群落的16s rdna進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間、不同環(huán)境的水體或土壤，其藍(lán)藻和硅藻群體的電泳圖譜構(gòu)成均不相同，形成高度特異的“群落指紋”?；诖耍髡咴O(shè)計(jì)課題將該技術(shù)引入法醫(yī)學(xué)用于溺死的診斷研究，以期建立一種特異性好、靈敏度高，既能定性診斷溺死，同時(shí)又能提示溺死地點(diǎn)的全新的分子生物學(xué)鑒定方法，且初步的研究結(jié)果較為理想。五、展望隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，dgge技術(shù)也會(huì)不斷發(fā)展，其突變檢測(cè)能力將進(jìn)一步增強(qiáng)。如gelfi等 將tgge與毛細(xì)管電泳結(jié)合建立了高度靈敏的溫度梯度毛細(xì)管電泳(temperature gradient capillary electrophoresis，tgce)技術(shù)并成功分析了囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cyfr) 基因外顯子17b 中的3個(gè)點(diǎn)突變(r1066h、r1066c和f1052v)和外顯子14a中的兩個(gè)多態(tài)性(v868v和t854t)。此外，將熒光技術(shù)與dgge結(jié)合的熒光多重復(fù)合dgge (fluorescent multiplexingof denaturing gradient gel el