凝膠過濾層析分離純化纖維素酶的研究

1、2003年第6期總第100期山東教育學(xué)院學(xué)報(bào)凝膠過濾層析分離純化纖維素酶的研究王玢1,袁方曜2(1.山東教育學(xué)院生物系,山東濟(jì)南250013;2.山東省農(nóng)科院,山東濟(jì)南250100)摘要:海洋細(xì)菌MB1產(chǎn)生的纖維素酶粗酶液,經(jīng)鹽析、透析,分別上葡聚糖凝膠層析柱SephadexG-100,SephadexG-75和SephadexG-50進(jìn)行分離純化,以SephadexG-75分離效果最好,得到一個(gè)電泳純的外切酶組分,該酶的比活力由6.94Umg-1提高到200.9Umg-1,提高了28.9倍,總收率8.6%。關(guān)鍵詞:纖維素酶;外切酶;凝膠過濾;柱層析;分離純化中圖分類號:Q814.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼

2、:A文章編號:10082816(2003)06008803隨著各種蛋白質(zhì)純化技術(shù)的出現(xiàn),纖維素酶的分離純化研究也取得了很大進(jìn)展,藥、飼料和紡織等領(lǐng)域,各,才能了解其組成、,質(zhì)纖維材料的作用特點(diǎn),開展纖維素降解機(jī)制的研究,為纖維素酶分子結(jié)構(gòu)研究、酶基因克隆、新酶分子的構(gòu)建和DNA體外定點(diǎn)誘變等提供依據(jù)。通常,纖維素酶的分離純化多采用離子交換層析。由于酶蛋白分子表面電荷的不均一性1,對離子交換劑表現(xiàn)了不同的親和力,且離子交換劑與酶蛋白分子之間的親和力不僅取決于酶分子表面攜帶電荷數(shù)目多寡,而且與其分子內(nèi)電荷排布有關(guān);而在離子交換層析中,只有分布在蛋白質(zhì)分子親水表面的電荷才發(fā)揮作用,而存在于分子疏水核

3、心中的電荷在離子交換中不起作用。因而,一個(gè)簡單的洗脫條件很難將多種酶蛋白分離開來,往往需要復(fù)雜的洗脫條件才能得到純酶。凝膠過濾層析是根據(jù)樣品中各種物質(zhì)分子量的不同,通過多孔凝膠床達(dá)到分離的目的2。這種方法條件溫和、簡便、分離范圍廣、回收率高,對生化物質(zhì)的分離十分適宜。取MB1菌種發(fā)酵液3于4,8000rpm,離心15分鐘,收。1.2:10,000NMWL透析袋,10,000NMWL聚。素酶活為102g/mL,蛋白質(zhì)含量為14.7mg/ml。-SPGE采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳,分離膠濃度12%,濃縮膠濃度4%,用0.25%(W/V)考馬斯亮收稿日期:20030711),女,山東濟(jì)南市人,講師;

4、袁方曜(1962),男,山東濟(jì)南市人,副研究員。作者簡介:王玢(1962取上述樣品各4mL,分別上SephadexG-100,SephadexG-75和SephadexG-50凝膠層析柱,結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3。活和微晶纖維素酶活得很高,沒有得到純酶。(2)圖2顯示,樣品經(jīng)SephadexG-75柱層析分離后,得到三個(gè)主要的峰。分別稱為峰、峰和峰。分別測定各峰液中的外切酶活和內(nèi)切酶活,結(jié)果表明,峰只具有較高的外切酶活。收集峰酶液,濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)果顯示,僅為一條帶,說明該組分已被提純。(3)圖3層析圖譜顯示,樣品SephadexG-50柱層析后,出現(xiàn)兩個(gè)主要的峰,經(jīng)測

5、定,峰內(nèi)切酶活和外切酶活均較高;峰主要是外切酶活,亦有少量內(nèi)切酶活,沒有分純。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用不同交聯(lián)度的葡聚糖凝膠SephadexG-100、SephadexG-75、SephadexG-50進(jìn)行纖維素酶分離純化,以SephadexG-75分純效果最好;經(jīng)SephadexG-75柱層析后,得到一個(gè)具有外切酶活的純組分。純化結(jié)果見表1。表1G-U)倍數(shù)(fold)128.9酶活收率ss1008.6圖1SephadexG-751020008840Fig.1ofSephadexG-1003討論(1)利用SephadexG-100、SephadexG-75和SephadexG-50三種葡聚糖凝

6、膠對纖維素酶進(jìn)行分離純化,以SephadexG-75分離效果最佳,得到一個(gè)電泳純的外切酶組分,比活圖2SephadexG-75凝膠層析圖譜Fig.2GelfiltrationchromatogramofSephadexG-75力提高了28.9倍。(2)凝膠過濾層析也稱為大小排阻層析,與其他類型的層析技術(shù)不同,凝膠柱系由均勻裝填的多孔凝膠微粒組成,蛋白質(zhì)分子據(jù)通過微孔遷移能力的不同而被分離。在理想的理論情況下,凝膠柱系不涉及蛋白質(zhì)與填料之間的吸附的排斥作用,故蛋白質(zhì)的遷移能力僅取決于其分子的大小,分子量大的物質(zhì)先被洗脫出層析柱,而分子量小的物質(zhì)后被洗脫下來,從而達(dá)到分離的目的;選用適宜的凝膠,并

7、保證其均一性,是純化成功與否的關(guān)鍵。(3)該纖維素酶純化的回收率較低,只有8%,可能與該適冷酶熱穩(wěn)定性較差有關(guān),雖然操作在4下進(jìn)行,但酶活喪失仍較高。參考文獻(xiàn):1何忠效等.現(xiàn)代生物技術(shù)概論M.北京:北京師范大學(xué)出版圖3SephadexG-50凝膠層析圖譜社,1999,168.ization:ALabroratoryCourseManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1996.3王玢,汪天虹等.產(chǎn)低溫纖維素酶海洋適冷菌的篩選和研究J.海洋科學(xué),2003,27(5):42-45.4HorikoshiK,NakaoM,KuronoY,etal.Cellulase

8、ofanalkalophilicFig.3GelfiltrationchromatogramofSephadexG-50(1)由圖1層析圖譜可以看出,樣品經(jīng)過SephadexG-100柱析分離后只得到一個(gè)大而緩的峰,峰液中的CMC酶王玢等:凝膠過濾層析分離純化纖維素酶的研究2003年第6期90779.5李建武等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法M.北京:北京大學(xué)出版社,1994,168-170.SeparationandPurificationofCellulasebyColumnChromatographyoftheGelFiltrationWangBin1,YuanFangyao2(1.Shando

9、ngeducationalcollege250013;2.ShandongAcademyofAgriculturalSciences250100)Abstract:ThecrudecellulaseextractionfromamarinebacteriumMB1wasseparatedandpurifiedbytheammoniumsulfateprecipitation,dialysisandcolumnchromatographyofSephadexG-100、SephadexG-75andSephadexG-50.TheeffectoftheSephadexG-75wasthebest

10、andonecellobiohydrolase(CBH)waspurifiedtoelectrophoretichomogeneitybySephadexG-75columnThespecificactivityoftheenzymewasraisedfrom6.94Umg-1to200.9Umg-1,whichwas28.timesthatofwithayieldof8.9%.Keywords:cellulase;cellobiohydrolase;gelfiltration;column(上接87ApplicationofCellVariantsinPlantYuHuimin,ShiZhu

11、(DepartmentofBiology,ShandongEducationCollege,Jinan250013,China)Abstract:Theexpetedadversity-resistanceofplantcellcanbeselectedbythetissuecultureinviroundercertainstressfactors.Thispa2permainlyanalysedandreviewedtheselectionandapplicationofallkindsofdirectivelyselectedcellvariantsreportedinrecentyears.Par2ticularly,thefocusofthispaperwasputonthecellvariantswhic