靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL(1)

1、靶向遞送人顆粒溶素與小鼠單鏈IL(1)】 目的:構建攜帶編碼人天然顆粒溶素（GLS）和小鼠單鏈IL12基因的真核共表達載體pZM03，并構建可將其靶向遞送入巨噬細胞中進行表達的重組恥垢分枝桿菌菌苗. 方法:將人GLS，小鼠單鏈IL12基因和分枝桿菌復制子OriM同時克隆進多啟動子真核共表達載體pBudCE4.1中，得到穿梭質粒pZM03.以pZM03電轉化恥垢分枝桿菌mc2155，通過PCR方法檢測重組菌中攜帶的真核共表達質粒；通過與小鼠巨噬細胞株RAW264.7共孵育檢測重組菌的靶向性. 結果:成功得到了可靶向遞送GLS/IL12真核共表達質粒pZM03進入巨噬細胞的新型重組菌. 結論:利用

2、恥垢分枝桿菌作為減毒生物體載體向巨噬細胞中靶向遞送真核表達質粒是可能的.【關鍵詞】 顆粒溶素；白細胞介素12；恥垢分枝桿菌；穿梭質粒；巨噬細胞0引言結核病位居單一病原引起死亡的嚴重傳染病之首1. 在結核病的感染、發(fā)病與治療過程中，宿主本身的免疫素質和免疫狀態(tài)是決定預后轉歸的重因素2. 其中巨噬細胞既是重的抗原呈遞細胞，也是參與形成潛伏感染的關鍵環(huán)節(jié). 本研究目的旨在構建一種攜帶人天然顆粒溶素（granulysin，GLS）和小鼠單鏈IL12基因的真核共表達載體pZM03、并可將其靶向遞送入巨噬細胞中進行表達的重組恥垢分枝桿菌治療性活疫苗. 為明確該重組疫苗的靶向遞送和目標基因在巨噬細胞內的轉錄

3、和表達效果，我們首先在細胞水平上進行了初步探索.1材料和方法1.1材料攜帶人GLS基因的質粒pGLS738由本實驗室構建；攜帶小鼠單鏈IL12基因的質粒pSFGmIL12由Graham J.Liechke博士惠贈，其中p40，p35兩亞單位基因由一45 bp的Linker連接，其編碼產(chǎn)物的生物學活性已在活體內證明；含有分枝桿菌復制子OriM的質粒pMV261及恥垢分枝桿菌mc2155由Torin博士3惠贈；多啟動子真核共表達載體pBudCE4.1購自Invitrogen公司；質粒pUC118購自大連寶生物公司；質粒pEGFPC1，E.coli Top10為本室保存；小鼠巨噬細胞株RAW264.

4、7購自第三軍醫(yī)大學藥理學教研室. 質粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒均購自上海華舜公司；小量組織/細胞總RNA抽提試劑盒、正常熔點瓊脂糖（NMA）、限制性核酸內切酶、高保真ProbestTaq酶、T4 DNA連接酶、逆轉錄試劑盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均購自大連寶生物公司；Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司；山羊抗人GLS抗體購自基因公司；即用型免疫細胞化學試劑盒購自武漢博士德公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；小牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品.1.2方法1.2.1pZM03質粒的構建根據(jù)GenBank（登錄

5、號：NM_006433）中人GLS的cDNA序列，設計引物P1，P2，分別含有BspEI，HindIII和BamHI酶切位點. P1的序列為 5GCTCCGGAAAGCTTCATATGGGCCGTGACTACAGGACCT3; P2的序列為5TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCACCTGAGGTCCTCACAGAT3，引物由大連寶生物公司合成. 由于表達產(chǎn)物定位于巨噬細胞胞質內表達，因此在引物設計中去除了GLS的分泌肽序列. 根據(jù)小鼠IL12 p40，p35兩亞單位編碼基因的序列設計P3，P4引物，分別含有EcoRI，NotI和HindIII，KpnI酶切位點. P3的序列為5GAAT

6、TCGCGGCCGCATATGGGTCCTCAGAAGCTAAC3; P4的序列為5GATAAGCTTGGTACCGGATCCTCAGGCGGAGCTCAGAT3. 引物由上海博亞生物公司合成. 根據(jù)pAL5000中OriM的編碼序列設計P5，P6引物，分別含有BamHI，NheI和NheI，HindIII酶切位點. P5的序列為5GGATCCGCTAGCTAAAGCCAGGTGAGCCCACCAGCTC3; P6的序列為5GCGAAGCTTGCTAGCGCACTACAACGGAGTTCGCCACGT3.引物由上海博亞生物公司合成. pZM03質粒的構建路線見圖1.圖1pZM03真核共表達質粒

7、的構建程序1.2.2重組質粒的細胞轉染及表達小鼠巨噬細胞株RAW264.7以含100 mL/L小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置24孔板內，以37, 50 mL/L CO2培養(yǎng)，按轉染試劑盒說明書用重組pZM03質粒和空質粒pBudCE4.1分別轉染RAW264.7細胞. 轉染48 h后分別收集實驗孔及對照孔的細胞做:以RTPCR法對兩種目的基因的mRNA進行檢測：抽提細胞總RNA進行逆轉錄，以各自的cDNA為模板，分別以P1和P2， P3和P4為引物，作PCR擴增；GLS表達產(chǎn)物的檢測：取出培養(yǎng)孔內細胞爬片進行免疫細胞化學檢測，具體方法按照試劑盒說明進行.1.2.3重組恥垢分枝桿菌菌苗的構

8、建及其靶向性檢測將對數(shù)生長期的mc2155菌株以預冷的100 mL/L甘油在4低溫洗滌3次4，取90 L感受態(tài)細菌加入10 L純化的pZM03質粒，輕輕混勻，冰浴10 min，轉入預冷的1 mm電轉杯中，2500 V，4 ms電擊一次，迅速加入0.8 mL完全7H9培養(yǎng)基，37孵育3 h后涂布到含Zeocin 40 mg/L的7H10固體平板上，37孵育72 h后挑取陽性菌落增菌后抽提質粒，同時取1 mL菌液，離心棄上清，沉淀加入0.5 mL三蒸水，100熱裂解8 min，取上清2 L或質粒抽提物1 L為模板，分別作GLS，IL12和OriM的PCR擴增. 以鑒定正確的重組菌11011 cfu

9、/L感染培養(yǎng)的RAW264.7細胞，12 h后取出培養(yǎng)孔內的細胞爬片進行抗酸染色并觀察. 同時將鑒定正確的重組菌劃線傳代510代后再次以PCR法進行鑒定，以觀察重組質粒的穩(wěn)定性.作者：伊正君，朱道銀，楊春，李俊明，何永林，陳全【關鍵詞】靶向comConstruction and identification of a Mycoba 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。2結果2.1pZM03質粒在小鼠RAW264.7細胞中的轉錄與表達在轉染有pZM

10、03質粒的RAW264.7細胞中同時擴增出了編碼人GLS和小鼠單鏈IL12的cDNA片段（圖2）. 圖中第1，4泳道分別為約267 bp的GLS片段和約1671 bp的IL12片段，與理論預計值圖2pZM03真核共表達質粒轉染RAW264.7細胞后轉錄產(chǎn)物的RTPCR結果完全相符. 用山羊抗人GLS抗體為一抗，生物素化的兔抗山羊抗體為二抗,對pZM03質粒轉染的小鼠RAW264.7細胞作免疫酶染色，發(fā)現(xiàn)在細胞質中有強陽性染色顆粒（圖3）.A:用pZM03質粒轉染后的RAW264.7細胞;B: 用pBudCE4.1質粒轉染后的陰性對照.圖3pZM03質粒轉染RAW264.7細胞48 h后顆粒溶素

11、的表達2502.2重組恥垢分枝桿菌菌苗的構建及其靶向性檢測以重組菌裂解物或質粒抽提物為模板，作GLS，IL12和OriM的PCR擴增（圖4）. 圖中第1，2和3泳道分別為約267 bp的GLS片段、約1671 bp的IL12片段和約1914 bp的分枝桿菌復制子OriM片段，與理圖4攜帶pZM03質粒的重組恥垢分枝桿菌菌落PCR鑒定論預計值完全相符. 感染RAW264.7細胞后進行抗酸染色觀察證明，重組菌具有良好的靶向遞送能力，能夠在目標細胞中巨量富集，鏡下可見紅色的抗酸染色菌株在巨噬細胞胞質中富集，巨噬細胞核呈藍色，在細胞間隙中只有極少量散在分枝桿菌的存在（圖5）.圖5感染12 h后RAW2

12、64.7細胞中重組分枝桿菌的富集10003討論細胞免疫是宿主抗結核感染的主保護機制，活動性結核病患者全身整體免疫狀態(tài)傾向于Th2型5-6. IL12是一種功能強大的Th1型免疫反應誘導劑，外源給予IL12可產(chǎn)生Th2免疫狀態(tài)向Th1型免疫狀態(tài)的逆轉. 在一個已建立Th2型免疫反應的感染動物中，外源給予IL12仍能誘導出一個獨立的與新免疫原相關的Th1型免疫反應，Pollock等7發(fā)現(xiàn)能夠促進Th2反應和強烈IgE反應的CPB2.8抗原當與IL12共同免疫小鼠時，依舊能夠引發(fā)出Th1型反應并與一定程度上的保護作用有關. 將共表達小鼠單鏈IL12與分枝桿菌保護性抗原Ag85B的真核質粒免疫小鼠，通

13、過細胞因子本身的生物學活性及其佐劑作用可以優(yōu)化宿主抗結核的特異性免疫反應，誘導機體產(chǎn)生更加有效的免疫保護作用8. 同時IL12對維持一定數(shù)量的Th1記憶細胞也是必需的9，但IL12只能通過刺激免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮治療作用，不能對巨噬細胞內的Mtb產(chǎn)生直接的殺傷作用.研究發(fā)現(xiàn)短尾猿用BCG第二次接種免疫后可激發(fā)2到9倍于初免時的V2V2 T細胞擴增，這是由于激活了初免時的記憶性T細胞，產(chǎn)生的回憶性反應引起的，并且這種擴增可持續(xù)7 mo之久，其擴增強度與保護短尾猿免受致死性Mtb攻擊有正相關10；另有學者利用來自PPD反應陽性健康者的外周血單個核細胞，研究了受抗原刺激后擴增的T細胞抑制巨噬細胞內分枝桿

14、菌生長的作用，發(fā)現(xiàn)BCG活菌苗和Mtb全細菌裂解液刺激的記憶性T細胞能顯著抑制分枝桿菌的胞內生長，而休眠T細胞缺乏此抑制能力，這表明休眠T細胞需特定的抗原刺激來激活.恥垢分枝桿菌是人體的正常菌群，使用重組恥垢分枝桿菌菌苗，一方面可作為新型減毒有機體載體向巨噬細胞靶向遞送GLS/IL12真核共表達質粒，另一方面還可對已經(jīng)感染結核桿菌的機體進行二次免疫激發(fā)，以對結核病進行交叉基因治療和免疫治療（同時還可以結合藥物治療）的綜合治療. 其原理是利用恥垢分枝桿菌菌體抗原與IL12共同作用于結核感染的機體后，通過分枝桿菌屬共同抗原促進并激發(fā)宿主針對結核桿菌的特異性細胞免疫，糾正機體的免疫狀態(tài)，間接清除體內

15、的結核桿菌；與此同時恥垢分枝桿菌還可以作為基因治療的減毒生物體載體，將含有激活的細胞毒性T淋巴細胞分泌的GLS基因的真核共表達質粒pZM03靶向導入巨噬細胞中表達，通過GLS與傳統(tǒng)藥物完全不同的機制直接殺滅胞內潛伏的結核桿菌，從而阻斷結核桿菌在巨噬細胞內的潛伏.我們將編碼人GLS的DNA片段和小鼠單鏈IL12基因、分枝桿菌復制子OriM同時克隆入pBudCE4.1后，構建了可在分枝桿菌中復制，同時又可以在真核細胞中進行共表達的穿梭質粒pZM03，并轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7，在體外從細胞水平同時檢測到了兩種基因的轉錄與表達產(chǎn)物，一方面表明在小鼠來源的巨噬細胞中同時獲得此兩種功能基因的表

16、達是可能的，另一方面也證明利用分枝桿菌作為生物體載體靶向遞送治療性基因是可能的. 這為后續(xù)在活體動物模型中應用該方法研究GLS，IL12及恥垢分枝桿菌的協(xié)同細胞免疫作用機制和免疫治療作用奠定了基礎.【參考文獻】1 Bryk R, Lima CD, ErdjumentBromage H, et al. Metabolic enzymes of mycobacteria linked to antioxidant defense by a thioredoxinlike protein J. Science, 2002,295(5557):1073-1077.2 Ottenhoff TH, Ver

17、reck FA, LichtenauerKaligis EG, et al. Genetics, cytokines and human infectious disease: lessons from weakly pathogenic mycobacteria and salmonellaeJ. Nature, 2002, 32(1):97-105.3 Bardarov S, Bardarov S Jr, Pavelka MS Jr, et al. Specialized transduction: an efficient method for generating marked and

18、 unmarked targeted gene disruptions in Mycobacterium tuberculosis, M. bovis BCG and M. smegmatisJ.Microbiology, 2002,148(Pt 10):3007-3017.4 Deol P, Vohra R, Saini AK, et al.Role of mycobacterium tuberculosis Ser/Thr kinase PknF: Implications in glucose transport and cell divisionJ. J Bacteriol, 2005,187(10):3415-3420.5 駱旭東, 朱道銀, 陳全, 等. 結核分枝桿菌A85B、MPT64 DNA疫苗免疫原性的比較J.第四軍醫(yī)大學學報,2003, 24（17）:1630-1631.6 江山, 朱道銀,蔣英,等. 結核分枝桿菌Ag85BAg85A雙抗原融合真核表達質粒的構建及表達J. 第四軍醫(yī)大學學報,2003,24（21）:1973-1975.7 Pollock KG, McNeil KS, Mottram JC, et al.The Leishma