血管內(nèi)皮生長因子反義寡核苷酸對白血病細胞系HL60細胞作用的研究

1、血管內(nèi)皮生長因子反義寡核苷酸對白血病細胞系HL?60細胞作用的研究    作者：孫玲，王一浩，劉少君，王芳，馬鴻雁，孫慧 席雨人    【摘要】 本研究探討VEGF ASODN抑制白血病細胞內(nèi)源性VEGF mRNA的表達作用及其與白血病細胞凋亡的關(guān)系。用陽離子聚合物介導(dǎo)硫代修飾VEGF ODN轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)白血病細胞系HL?60細胞后，采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，RT?PCR檢測VEGF mRNA表達，以細胞形態(tài)學(xué)，凝膠電泳，流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡。結(jié)果顯示： 反義組與錯義組、空白對照組相比，在細胞增殖抑制率和V

2、EGF mRNA的表達水平方面均具有顯著性差異(p<0.05)；錯義組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。反義組可見細胞皺縮，顆粒增多，核固縮并出現(xiàn)細胞碎片，而錯義組、空白對照組細胞輪廓清楚，胞體透亮，生長旺盛；反義組有凋亡梯形帶，錯義組和空白對照組僅見1條DNA條帶；反義組細胞凋亡率達19.46，與錯義組、空白對照組相比具有顯著性差異（p<0.05）；錯義組與空白對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。 VEGF ASODN聯(lián)合VP16的細胞凋亡率與等同條件單用VP16組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）； 且凋亡率具有時間和劑量依賴關(guān)系。結(jié)論： VE

3、GF ASODN能抑制白血病細胞內(nèi)源性VEGF mRNA的表達，誘導(dǎo)白血病細胞的凋亡，抑制增殖，且增強VP16對白血病細胞誘導(dǎo)凋亡作用，兩者聯(lián)合效應(yīng)具有相加作用。    【關(guān)鍵詞】 白血病    Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Antisense Oligonucleotide on Human Leukemic Cell Line HL?60    Abstract    Th

4、is study was aimed to investigate expression of vascular endothelial growth factor mRNA (VEGF mRNA) and its relationship with leukemic cell apoptosis after VEGF antisense oligonucleotide(VEGF ASODN )transferred into HL?60 cells. The phosphorothiate VEGF ODN was transferred into HL?60 cells in vitro

5、by using cation poly mediated method, the inhibitory rate of cell proliferation was assayed by MTT, expression of VEGF mRNA was measured by RT?PCR, cell apoptosis was detected by cell morphology observation, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometer (FCM). The results showed that difference

6、 of    the inhibitory rate of cell proliferation and the relative expression of VEGF mRNA    between ASODN group and MSODN or control groups under the same condition（p<0.05）    was statistic significant, but no significant difference （p&

7、gt;0.05） was found between MSODN and control. The number of clusters of cells in ASODN group decreased; the morphology features of apoptotic cells involved cell shrinking,more granulation in cytoplasm, nuclear contracting and many fragments of cells. In MSODN and control groups, however, cells were

8、plump and clear, and grow healthly. The result of electrophoresis revealed DNA ladder in ASODN group, while only one band of DNA in control groups.The rate of cell apoptosis was 19.46 in ASODN group with a significant difference as compared with MSODN groups and control（p<0.05）.The rate of HL?60

9、cell apoptosis in combination of VEGF ASODN with VP16 was significantly higher than that in VP16 alone （p<0.05） and showed time? and dose? dependence. It is concluded that VEGF ASODN can down?regulate expression of VEGF mRNA of HL?60 cells, induces the apoptosis , inhibits the proliferation of HL

10、?60 cells and enhances VP16?induced apoptosis in HL?60 cells, the VEGF ASODN in combination with VP16 shows additive effect.    Key words    VEGF；leukemia；antisense oligonucleotide； HL?60 cell; apoptosis    J Exp Hematol 2007; 15(4):849-853

11、    血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是一種多功能的糖基蛋白，在白血病患者體內(nèi)呈高表達。體外白血病細胞株的培養(yǎng)證實， 白血病細胞不僅分泌 VEGF, 而且表達特異性 VEGF受體, VEGF 可通過旁分泌參與白血病細胞的增殖及浸潤，而且與白血病細胞表面特異性受體結(jié)合促進白血病細胞生長及降低對放化療的敏感性。對其機制目前尚存有爭議，有學(xué)者認為VEGF可直接促進白血病細胞增殖，而有學(xué)者認為VEGF具有抗凋亡作用。本研究針對上述爭議通過反義技術(shù)直接封閉內(nèi)源性VEGF表達觀察白血病細胞生長情況

12、，探討VEGF和白血病細胞的關(guān)系。    研究對象    白血病細胞系HL?60由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎教研室提供。    試劑和設(shè)備    RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司產(chǎn)品)，胎牛血清(TBD公司產(chǎn)品)，TRIzoL Reagent(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，梭華SofastTM 基因轉(zhuǎn)染試劑盒(廈門太陽馬生物工程有限公司產(chǎn)品)，Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis K

13、it(加拿大MBI 公司產(chǎn)品)，PCR試劑盒(上海Sangon 生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品)，Annexin V?FITC 試劑盒(晶美生物工程有限公司產(chǎn)品)，VP16(山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品)，CO2孵育箱(德國Heraeus公司產(chǎn)品)，Eagle eyeTM凝膠掃描分析系統(tǒng)(美國Stratagene公司產(chǎn)品)，DNA熱循環(huán)擴增儀PE480(美國PE公司產(chǎn)品)，流式細胞儀EPILS_XL(美國Beckman?Coulter公司產(chǎn)品)。    硫代磷酸寡脫氧核苷酸（thiophospate oligonucleotide，ODN）和引物的合成 

14、   VEGF ODN按參考文獻1由上海Sangon生物工程技術(shù)服務(wù)公司391型DNA合成儀(PE公司)合成。VEGF ASODN:5 T GGCTTGAAGATCTCGAT 3，VEGF MSODN:5 TACGTATGGTGTACGATC 3，VEGF引物擴增產(chǎn)物545 bp；VEGF上游引物:5 T CGGGCCTCCGAAACCATGA 3，VEGF下游引物:5 CCTGGAGAGAGATCTGGTTC 3；?actin內(nèi)參照擴增產(chǎn)物為300 bp，上游引物：5?TCCTGTGGCATC CACGAAACT?3，下游引物：5?GAAGCATTTGCG GT

15、GGACGAT?3。    細胞培養(yǎng)    采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，將HL?60細胞置于37、5% CO2、飽和濕度的恒溫孵育箱中培養(yǎng)2。    VEGF ODN對HL?60細胞增殖及VEGF mRNA表達的影響    將VEGF ASODN、MSODN各配成5，10，20 mol/L 3 種不同濃度。嚴格按照梭華?SofastTM 基因轉(zhuǎn)染試劑盒說明書具體步驟操作。    

16、;增殖抑制率的MTT法檢測    按MTT法常規(guī)操作，檢測增殖抑制率，增殖抑制率計算公式如下：    增殖抑制率（1實驗組值/空白對照組值）×100%    VEGF mRNA表達的RT?PCR檢測    實驗分為3組： ASODN組、MSODN組、空白對照組。空白對照組加入相同量不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，以?actin為內(nèi)對照，用RT?PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后各組HL?60細胞VEGF mRNA的表達。采用6孔培養(yǎng)板，

17、按照上述步驟將20 mol/L VEGF ASODN轉(zhuǎn)染HL?60細胞48小時后，參照TRIzoL提取試劑盒說明書抽提RNA,提取的6 l RNA樣品在含6%甲醛的15 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳，在電壓8 V/cm下電泳30分鐘后，置于凝膠掃描成像系統(tǒng)下觀測結(jié)果并照相檢測RNA的完整性。用分光光度法作單鏈RNA的定量，參照試劑盒說明書cDNA制備進行操作，完成cDNA合成后進行PCR擴增。取8 l加有載樣緩沖液的擴增產(chǎn)物加至含有溴化乙錠的2瓊脂糖凝膠中，在電壓8 V/cm下電泳60分鐘后，置凝膠掃描成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并照相。將各樣本的PCR光密度值除以各內(nèi)對照?actin的PCR光密度值，以

18、其比值作為各目的mRNA的表達量。檢測重復(fù)3次。    VEGF ODN對HL?60細胞凋亡的影響    VEGF ODN轉(zhuǎn)染HL?60細胞48小時后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。收獲各組細胞，提取DNA置瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察并凝膠掃描照相。按FCM Annexin V?FITC 試劑盒說明書操作上機檢測細胞凋亡率。    VEGF ODN與VP16聯(lián)合對HL?60細胞作用    實驗分組如下：VEGF ASODN VP?

19、16(5 g/L)組, VP?16(5 g/L) 組； VEGF ASODN VP?16(10 g/L) 組, VP?16(10 g/L) 組； VEGF ASODN VP?16(20 g/L) 組, VP?16(20 g/L) 組；空白對照組。取濃度均為2×105/L細胞100 l接種于96孔板，按上述步驟轉(zhuǎn)染VEGF DON，同時加入不同濃度的VP?16。每組設(shè)3個平行孔，重復(fù)2次。VEGF ASODN與VP16作用后用流式細胞儀測定細胞凋亡。    統(tǒng)計學(xué)處理    結(jié)果用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件

20、處理,檢驗標準以p<0.05為差異有顯著性。    結(jié)    果    VEGF ODN對HL?60細胞生長的抑制作用    MTT檢測結(jié)果顯示，相同條件的反義組細胞增殖抑制率明顯高于錯義組（p<0.05），且在相同時間點抑制率隨VEGF ASODN濃度而遞增，相同濃度的VEGF ASODN對細胞增殖抑制率隨時間而遞增， 20 mol/L和48小時分別是本試驗VEGF ASODN的最適作用濃度和時間（表1）。 &#

21、160;  瓊脂糖凝膠電泳圖能清楚見28S rRNA、18S rRNA及5S rRNA或5.8S rRNA 3條清晰條帶，提示抽提的總RNA完整性好（圖1）。所提RNA經(jīng)紫外分光光度儀分析，其OD280/OD260比值均在1.8-2.0之間，提示無蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)污染，RNA的濃度為0.3-0.5 g/l。    VEGF ODN 對HL?60細胞VEGF mRNA表達的影響    反義組VEGF mRNA相對表達率與錯義組、空白對照相比均有顯著性差異（p<0.05），錯義組與空白對照相比

22、無顯著性差異（p>0.05）(表2、圖2)。    細胞形態(tài)學(xué)的改變    反義組細胞集落減少，胞體縮小，胞膜皺縮，胞漿中顆粒增多，染色質(zhì)凝集，核固縮并出現(xiàn)細胞碎片；而錯義組、空白對照組細胞均呈半貼壁生長，細胞輪廓清晰，胞體透亮，生長旺盛（圖3）。    細胞DNA的電泳變化    瓊脂糖凝膠電泳顯示：錯義組和空白對照組均僅在靠近加樣孔處見1條完整的DNA帶，而反義組見到多條明顯向遠端延伸的典型凋亡梯形帶（圖4）。Figure 3

23、. Morphology of HL?60 cells transferred by VEGF CDN (incubated for 48 hours, ×200).    細胞凋亡的水平    FCM檢測顯示，反義組細胞凋亡率達19.46，與錯義組、空白對照組的凋亡率3.27、2.61相比具有顯著性差異（p<0.05）（表3）。    討    論    研究表明，VEGF在白血

24、病患者血清及體外白血病細胞株的培養(yǎng)液和胞漿中均有不同程度地異常高表達；VEGF不僅通過促進骨髓血管新生改變骨髓微環(huán)境促使白血病細胞的增殖浸潤3，而且還能直接通過自分泌途徑促進白血病細胞增殖，加速白血病發(fā)展，影響白血病治療效果和預(yù)后4-6。內(nèi)源性VEGF促進白血病細胞自身生長增殖，其機理是VEGF如癌基因那樣直接促進白血病細胞有絲分裂，還是抗凋亡作用，目前研究者對此認識尚有分歧。假設(shè)VEGF是通過抗凋亡機制促進白血病細胞增殖，那么用反義技術(shù)封閉VEGF基因表達后就能促進白血病細胞凋亡。我們的研究結(jié)果證實了這一假設(shè)，利用陽離子聚合物VEGF ASODN作用于白血病細胞后能顯著抑制白血病細胞增殖，通

25、過MTT檢測其抑制率達67.29，且抑制率呈時間和劑量依賴關(guān)系。轉(zhuǎn)染20 mol/L VEGF ASODN作用HL?60細胞48小時后細胞凋亡率達19.46，反義組凋亡率與錯義組、空白對照組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），而錯義和空白對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。VEGF與白血病細胞凋亡密切相關(guān)，雖然不清楚VEGF是否具有直接促白血病細胞有分裂作用，但證實VEGF在很大程度上是通過抗凋亡而促進白血病細胞增殖。    實驗結(jié)果提示VEGF有抗凋亡作用，其抗凋亡機制又是什么呢？日本學(xué)者Katoh等7用臺盼藍染色計數(shù)法研究表明,VEG

26、F能夠抑制VP16和ADM引起的白血病細胞凋亡。應(yīng)用VEGF刺激白血病細胞株CMK86之后,用Northern blot檢測Bcl?2家族的表達水平,發(fā)現(xiàn)其中只有抗凋亡基因mcl?1的mRNA水平增高。Kuramoto等8利用載體轉(zhuǎn)染技術(shù),得到mcl?1表達增強的白血病細胞株U937,經(jīng)VP16處理,mcl?1能夠降低由于化療作用激發(fā)的caspase 3活性,提高細胞轉(zhuǎn)染的存活力。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), VEGF刺激CMK86細胞和人類造血祖細胞后,一種鋅指蛋白ZK7的mRNA表達,該蛋白可能與VEGF及其受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。用轉(zhuǎn)染了ZK7的細胞觀測其對電離輻射和VP16的敏感性，發(fā)現(xiàn)較親代細

27、胞降低，表明ZK7蛋白可能作為造血細胞的凋亡抑制因子發(fā)揮作用，VEGF能夠誘導(dǎo)白血病細胞穩(wěn)定而過量表達ZK7，說明VEGF可能通過多種機制抑制白血病細胞凋亡。其他學(xué)者致力此項研究得出許多理論實驗結(jié)果9，10。此外，本試驗研究結(jié)果還提示陽離子聚合物介導(dǎo)VEGF ASODN轉(zhuǎn)染白血病細胞后其細胞增殖抑制率明顯高于既往文獻報道11，12，這可能與本試驗應(yīng)用陽離子聚合物介導(dǎo)VEGF ASODN轉(zhuǎn)染HL?60細胞，且采用硫代磷酸修飾反義寡核苷酸增加穩(wěn)定性有關(guān)13。試驗操作提示，陽離子聚合物介導(dǎo)的硫代修飾VEGF ASODN 轉(zhuǎn)染HL?60細胞時整個轉(zhuǎn)染操作不改變培養(yǎng)液的血清濃度， HL?60細胞均在恒定

28、血清濃度中培養(yǎng)，陽離子聚合物可提高VEGF ASODN轉(zhuǎn)染效率；在取得等同轉(zhuǎn)染效果時降低了VEGF ASODN的最低有效濃度，這為陽離子聚合物介導(dǎo)的硫代修飾VEGF ASODN逐步應(yīng)用于臨床提供了理論基礎(chǔ)，陽離子聚合物介導(dǎo)的硫代修飾VEGF ASODN將可能成為治療白血病的一種新藥物。    VP16是一種DNA拓撲異構(gòu)酶抑制劑，能夠誘導(dǎo)白血病細胞凋亡。VEGF ASODN聯(lián)合VP16作用HL?60細胞其效果具有相加作用， VEGF ASODN可增加HL?60細胞對VP16的敏感性，減少藥物最低有效濃度，降低其毒副作用，提高療效。VP16聯(lián)合VEGF A

29、SODN可能成為白血病治療的一種新方案，這將為白血病治療提供新的途徑。 【參考文獻】 1費嘉,張洹.血管內(nèi)皮生長因子基因反義核酸設(shè)計及其對HL?60細胞生長的影響.暨南大學(xué)學(xué)報，2003；24：1-62司徒鎮(zhèn)強, 吳軍正主編. 細胞培養(yǎng).西安.世界圖書出版公司.2003: 128-1293de?Bont ES, Rosati S, Jacobs S， et al. Increased bone marrow vascularization in patients with acute myeloid leukaemia: a possible role for vascular endothe

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