表達(dá)反義hREV3基因片段的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1、    表達(dá)反義hREV3 基因片段的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建*        摘要目的:構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)重組體，為今后利用反義核酸阻斷技術(shù)研究hREV3基因功能及其與細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定性的關(guān)系提供物質(zhì)材料。方法:用內(nèi)切酶BamH I及BamH I+Hind 分別對pBS-hREV3進(jìn)行單酶切和雙酶切,從而得到含hREV3 cDNA特異性保守序列的兩種長度(742bp 和357bp)片段,分別將兩者插入真核細(xì)胞表達(dá)載體:pBK-RSV(持續(xù)表達(dá)載體)和pMAMneo am

2、p-(表達(dá)需經(jīng)地塞米松誘導(dǎo))。結(jié)果:經(jīng)酶切譜分析,篩選出含正向和反向插入片段真核細(xì)胞表達(dá)重組體5種。結(jié)論:為深入研究hREV3基因功能奠定基礎(chǔ)。主題詞遺傳學(xué)；基因， REV；RNA，反義 Construction of eukaryotic expression plasmid expressing antisense fregment of hREV3XU Fang， YU Ying-Nian， HU Wen-Wei Dept. of Pathophysiology,Zhejiang University,Hangzhou(310031)Abstract AIM: To construct

3、the eukaryotic expression plasmid to study the role of hREV3 gene in genesis of genetic instability by means of antisense technology. METHODS: Two fragments with different length (742bp and 357bp) that constain the specific conserved region of hREV3 cDNA were obtained by digesting plasmid pBS-hREV3

4、with restriction enzymes BamH I and BamH I plus Hind III respectively .Two kinds of fragments were inserted into two kinds of eukaryotic expression vector : pBS-RSV(used for constant expression and pMAMneo amp-(used for inducible expression).The inserting orientation of recombinants were identified

5、by digesting with restriction enzymes and electrophoresis analysis. RESULTS: Obtained five kinds of recombinant containing the insertions in sense and antisense orientation. CONCLUSION: These results provide an important basis to further study in genetic instability.MeSH Genetics; Genes, REV; RNA, a

6、ntisenseREV3基因是近年來在酵母研究中發(fā)現(xiàn)的,它與REV7共同編碼合成DNA聚合酶 (Pol),參與DNA損傷誘導(dǎo)的突變形成。REV3基因突變不僅能降低由于紫外線、離子輻射或烷化劑處理造成的DNA損傷誘導(dǎo)的突變形成,而且能使真菌自發(fā)突變率降低20%1,2。人Pol的編碼基因cDNA已從人的cDNA文庫中克隆出,命名為hREV3（2.1kb),定位于染色體1p3233,其mRNA>10kb,并證實它在一些腫瘤中表達(dá)增高3，提示其表達(dá)增高與腫瘤發(fā)生有關(guān),可能對遺傳不穩(wěn)定的誘發(fā)起著重要作用。我們將利用反義RNA技術(shù)來特異性阻斷真核細(xì)胞hREV3基因的表達(dá),由于真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控復(fù)雜

7、,在研究hREV3基因功能時,我們構(gòu)建了誘導(dǎo)表達(dá)的和持續(xù)表達(dá)的反義重組質(zhì)粒，構(gòu)建中獲得的正向插入的重組體將作對照用。材料與方法一、質(zhì)粒與有關(guān)酶：pBS-hREV3 加拿大Saskatchewan大學(xué)W.Xiao博士提供,pBS-hREV3為含有hREV3基因全編碼序列(2.1kb3)的pBluescript SK、重組質(zhì)粒; pMAMneo amp-本室提供4,從pMAMneo (Clontech公司)改建而得,在細(xì)菌中擴增具有卡那抗性,外源基因的表達(dá)需地塞米松誘導(dǎo);pBK-RSV(Stratagene公司)。限制性內(nèi)切酶購自ToKaRa公司和Promega公司。二、兩種長度hREV3 cDN

8、A目的片段的制備：對pBS-hREV3進(jìn)行雙酶切和單酶切得到含有hREV3cDNA特異性保守序列的兩種片段：357 bp短片段(hREV3 short fragment ,RS表示)和742 bp長片段(hREV3 long fragment,RL表示，另帶有pBS載體上極小的一段序列)。電泳分離,透析袋法回收目的片段。 三、重組子構(gòu)建：1.持續(xù)表達(dá)載體pBK-RSV與兩種長度目的片段(RS、RL)重組體構(gòu)建：酶切pBK-RSV和pBS-hREV3，4 ，T4 DNA 連接酶連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5，提取質(zhì)粒。單酶切的片段有正、反方向插入, 酶切篩選出正向和反向重組質(zhì)粒, 以:pB-RL

9、(+)、pB-RL(-)表示(此處pB表示載體pBK-RSV ；+、-分別表示正、反方向) 。雙酶切的片段只以一種方向插入,篩選得到一種反向重組質(zhì)粒，以pB-RS(-)表示（1）。Fig 1 Construction of recombinanB:BamHI； H:Hind；S:Sall； pB:pBK-RSV；pM:pMAMneo amp-；+：ordinary orientation; -：reverse orientation;RL:long fragment of hRev 3(742 bp); RS:short fragment of hRev 3(357 bp)1構(gòu)建重組體技術(shù)路線

10、2.誘導(dǎo)表達(dá)載體pMAMneo amp-與357bp hREV3 cDNA片段(RS)的重組體構(gòu)建：酶切重組體pB-RS(-)和載體pMAMneo amp-(以pM表示)，4 , T4 DNA連接酶連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5,在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選取單菌落,酶切篩選出正向和反向重組體，分別以：pM-RS(+)、pM-RS(-)表示 (1)。結(jié)果一、重組體構(gòu)建及其正反取向的鑒定：1.持續(xù)表達(dá)載體pBK-RSV與hREV3短片段(RS)構(gòu)建的重組體pB-RS（-）(2)：對選出的質(zhì)粒（Lane 4），用BamH I+Hind III雙酶切進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，該質(zhì)粒被切出2條片段：357bp、

11、4434bp(Lane 7)，分別與同樣雙酶切自質(zhì)粒pBS-hREV3及表達(dá)載體所得到的片段357bp（Lane 5）和4434bp（Lane 6）長度同，故確認(rèn)該質(zhì)粒為重組體，并為反向重組體,定名為:pB-RS(-)。Fig 2 Electrophoretic analysis of recombinant pB-RS(-)1. DNA/Hind Markers; 2. pBS-hREV3 digested with EcoR；34. pBK-RSV and pB-RS(-) digested with BamH I; 57. pBS-hREV 3、 pBK-RSV and pB-RS(-)

12、 digested with (Bam H +Hind); 8. pGEM-7Zf(+)/Hae DNA Markers2pB-RS(-)重組體鑒定2.持續(xù)表達(dá)載體pBK-RSV與hREV3長片段(RL)構(gòu)建的重組體pB-RL(+)、pB-RL(-) (3)：選出的兩個質(zhì)粒, 經(jīng)BamHI酶切均得到2條片段742bp和4452bp(Lane45),分別與pBS-hREV3和pBK-RSV自BamHI酶切所得片段742bp (Lane2)和4452bp(Lane3)相同,故可確定此兩個質(zhì)粒為重組體,暫定名為pB-RL-1和pB-RL-2。 用Hind III酶切鑒定方向，正向插入應(yīng)有：375bp

13、和4819bp 2條片段，而反向插入應(yīng)有：403bp和4791bp 2條片段。經(jīng)分析確認(rèn)pB-RL-1（Lane7）為正向插入重組體pB-RL(+); pB-RL-2（ Lane8）為反向插入的重組體pB-RL(-) 。Fig 3 Electrophoretic analysis of recombinants pB-RL(+) and pB-RL(-)1. DNA/Hind Marers; 25. pBS-REV 3、 pBK-RSV、 pB-RL-1 and pB-RL-2 digested with Bam H ; 68. pBK-RSV、 pB-RL-1 and pB-RL-2 dig

14、ested with Hind; 9. pGEM-7Zf(+)/Hae DNA Markers3重組體pB-RL(+)和pB-RL(-)鑒定3.誘導(dǎo)表達(dá)載體pMAMneo amp-與hREV3短片段(RS)構(gòu)建的重組體pM-RS(+)、pM-RS(-)(4)：對選出的質(zhì)粒作進(jìn)一步酶切鑒定，用Hind III + Sal I雙酶切該質(zhì)粒和表達(dá)載體，由于表達(dá)載體上有2個Hind III位點和1個Sal I位點，插入片段上有1個Hind III位點，故載體可被切出3條片段：5722bp、1214bp、1464bp(Lane 3);而重組體則被酶切出：5722bp、1214bp、1464bp、369b

15、p 4條片段(lane 45),其中前3條與表達(dá)載體同，后1條為帶有hREV3短片段（357bp）的一條,由此可確認(rèn)Lane 45的兩個質(zhì)粒均為重組體，暫定名為pM-RS-1和pM-RS-2。鑒定重組體正、反向可用BamH I酶切，pMAMneo amp-上有3個BamH I位點，插入片段上有1個BamH I位點，因此pMAMneo amp-可被酶切出3條帶4563bp、2688bp、1149bp（Lane 6）, 而正向重組體可被切出：4071bp、2688bp、1149bp、867bp 4條片段；反向重組體可被酶切出：3696bp、2688bp、1149bp、1242bp 4條片段(后2條

16、在電泳時分辨不開，合為1條)，由此確認(rèn)pM-RS-1（Lane7）為正向重組體pM-RS(+); pM-RS-2（Lane8）為反向重組體pM-RS(-)。Fig 4 Electrophoretic analysis of recombinant pM-RS(+) and pM-RS(-)1. DNA/Hind Markers; 2. pBS-hREV 3 digested with (BamH I+ Hind ); 35. pMAMneo amp-、 pM-RS-1、 pM-RS-2 digested with (Hind +Sa1 1)；68.pMAMneo amp-、 pM-RS-1、

17、pM-RS-2 digested with BamH I； 9. pGEM-7Zf(+)/Hae DNA Markers4重組體pM-RS(+)和pM-RS(-)鑒定討論本實驗室發(fā)現(xiàn)在小劑量烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)處理引起的哺乳類細(xì)胞不穩(wěn)定現(xiàn)象中，存在DNA復(fù)制保真度下降5,而DNA復(fù)制保真度直接影響并維持著生物遺傳的穩(wěn)定性，現(xiàn)已知在細(xì)胞中DNA復(fù)制保真度主要由參與DNA聚合酶的校讀作用及錯配修復(fù)機制維持的。在MNNG 處理細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)有錯配修復(fù)功能的改變6 ,但證明烷化劑處理

18、后可以誘導(dǎo)一些基因表達(dá)的改變7，其中包括DNA聚合酶譜的改變。本實驗室已用逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)證明在MNNG處理后DNA聚合酶、與拓?fù)洚悩?gòu)酶的表達(dá)并無變化，但無3校讀功能的DNA聚合酶表達(dá)明顯升高8，9，由于它缺乏校讀功能，因此它的表達(dá)升高有可能與DNA復(fù)制保真度的降低和細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定有關(guān)。DNA聚合酶(Pol)是近年來發(fā)現(xiàn)的又一種DNA聚合酶,它無35外切酶活性，而具有跨損傷修復(fù)活性（效率達(dá)10% ，Pol只有1%),REV3基因是編碼該酶的重要基因,在真菌中跨損傷修復(fù)及甲基損傷的堿基切除修復(fù),均需要REV3蛋白的參與,該基因的突變可降低細(xì)胞自發(fā)突變率10,可能對遺傳不穩(wěn)定的誘發(fā)起著重要作用。

19、編碼人的Pol的基因（hREV3基因）是在1998年才被克隆和鑒定的3，以往的研究中未對MNNG處理后它的表達(dá)改變進(jìn)行觀察，目前已知人類的該基因在腫瘤中具有高表達(dá),可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。因此研究hREV3基因的功能以及其與細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定產(chǎn)生的關(guān)系，對于研究腫瘤和遺傳性疾病有重要的作用。我們將用本文構(gòu)建的反義表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞，通過反義核酸阻斷技術(shù)來特異阻斷hREV3基因在真核細(xì)胞中的表達(dá),并對細(xì)胞自發(fā)突變率及誘發(fā)突變率進(jìn)行檢測,以期做出對hREV3基因在細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定中作用的評價。* 國家自然科學(xué)基金重點項目（No.39830210）和寧夏教育廳科研基金資助徐方寧夏醫(yī)學(xué)院生物教研室（銀川 75

20、0004）作者單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 (杭州 310031)參考文獻(xiàn)1Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Deoxcytidyl transferase activity of yeast Rev1 protein.Nature,1996,382:729.2Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase .Science,1996,272:1646.3 Xiao W, Lawchler T,Chow BL, et al. Identification ,chromosome mapping and tissue-specific expression of hREV3 encoding a putative human DNA polymerase .Carcinogenesis,1998,