淺析2型腺相關(guān)病毒重組綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)

1、淺析2型腺相關(guān)病毒重組綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)    【摘要】  目的 探討2型重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus 2, rAAV-2）載體能否有效地轉(zhuǎn)染NSCs。 方法 采用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）報(bào)告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染復(fù)數(shù)（multiplici

2、ty of infection, MOI）分別為1×104、1×105、1×106轉(zhuǎn)染體外分離、培養(yǎng)的大鼠胎鼠NSCs，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)；同時(shí)檢測(cè)子代細(xì)胞的活力、增殖倍數(shù)、分化情況來(lái)評(píng)估對(duì)其存活、增殖、分化能力的 影響 ；當(dāng)EGFP表達(dá)穩(wěn)定后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)rAAV-2/EGFP對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果 轉(zhuǎn)染10天后各轉(zhuǎn)染組便可觀察到NSCs克隆球發(fā)出綠色熒光，起始熒光強(qiáng)度不一，隨MOI值的增大而增強(qiáng)；各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，至轉(zhuǎn)染21天后達(dá)高峰并維持，此時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)

3、rAAV-2對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)染效率：MOI為1×104、1×105、1×106時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為25.68%、50.60%、54.72%, 熒光指數(shù)（FI）分別為4.08、12.72、14.06；轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)7、14、21天時(shí)其細(xì)胞活力、增殖倍數(shù)、分化差異均無(wú)顯著性。結(jié)論 rAAV-2能有效地轉(zhuǎn)染NSCs，所介導(dǎo)的目的基因能高效表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  神經(jīng)干細(xì)胞；2型腺相關(guān)病毒；轉(zhuǎn)染；感染復(fù)數(shù)；綠色熒光蛋白；熒光指數(shù)；細(xì)胞活力    【Abstract】 

4、60;Objective  To investigate the transfection efficiency of recombinant adeno-associated virus 2 （rAAV-2） in cultured neural stem cells.Methods  The neural stem cells of rat e

5、mbryo cultured, indentified in vitro was infected with the rAAV-2 expressing the enhanced green fluorescent protein（EGFP） gene by different multiplicity of infection（MOI=0,1×104,1×105,1

6、×106 ）. After transfection, the expression of EGFP was detected by fluorescent microscope. At the same time, the cytotoxicity of rAAV-2 to NSCs was evaluated by cell

7、 proliferation, cell vitality and cell differentiation. The tranfection efficiency was evaluated by flow cytometer.Results  EGFP was initially expressed in the neural stem cells-dr

8、ived neurosphere of all transfected groups 10d following infected by rAAV-2/EGFP.The level of expression increased with the increase of MOI, subsequently gradually increased and re

9、ached peak on 21d.Transfection efficiency and fluorescent index （FI） were 25.68%, 4.08 （MOI=1×104）; 50.60%, 12.72 （MOI=1×105）; 56.72%, 14.06 （MOI=1×106） respectively. During the

10、60;period of the culture, cell proliferation, cell vitality and cell differentiation in the transfected and untransfected group had no difference.Conclusions  The rAAV-2 can transf

11、ect neural stem cells efficiently, and the rAAV-mediated transfer of the gene can be expressed in the NSCs.    【Key words】  neural stem cells；recombinant associated&

12、#160;adeno virus 2;  transfection; multiplicity of infection;  green fluorescent protein; fluorescent index；cell vitality    綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一種新的報(bào)告基因，由于其表達(dá)產(chǎn)物GFP可被直接激發(fā)產(chǎn)生熒光，不需要任何

13、底物或輔助因子，較傳統(tǒng)的標(biāo)記基因如2-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因等更具有明顯的優(yōu)越性；在GFP的基礎(chǔ)上進(jìn)行F64L和S65T的突變從而形成增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），EGFP增強(qiáng)了GFP的熒光性能，更容易觀察、檢測(cè)1。2型腺相關(guān)病毒具有與人類(lèi)疾病無(wú)相關(guān)性、宿主范圍廣、可整合入細(xì)胞染色體DNA介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),是較理想的基因載體2。隨著神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的分離、培養(yǎng)、純化及生物學(xué)功能 研究 深入35，尋

14、找NSCs基因修飾載體及標(biāo)記分子，已成為研究NSCs在體內(nèi)、外分化調(diào)控和細(xì)胞工程基因 治療 中樞系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)。運(yùn)用基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞治療中樞系統(tǒng)疾病具有細(xì)胞修復(fù)和轉(zhuǎn)基因治療的雙重優(yōu)勢(shì)。理想的基因轉(zhuǎn)移載體是基因修飾的關(guān)鍵。    1  材料與方法    1.1  病毒載體  rAAV-2/EGFP購(gòu)于863生物領(lǐng)域病毒基因載體研究開(kāi)發(fā)基地、北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)股份有限公司，滴度為5×1011v.g/ml。 

15、60;  1.2  神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定6   按 參考 文獻(xiàn) 進(jìn)行，體外分離胚胎大鼠大腦額葉皮質(zhì)、懸浮培養(yǎng)，經(jīng)Nestine鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞（見(jiàn)圖1），作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。    1.3  主要試劑、儀器  DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（HyClone公司產(chǎn)品）；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）（SIGMA公司產(chǎn)品）；兔抗巢蛋白Nestin抗體、羅丹明標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋公司產(chǎn)

16、品）。相差倒置顯微鏡（Cannon）、倒置熒光顯微鏡（Nikon）、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、流式細(xì)胞儀（BD）。    1.4  rAAV-2/EGFP體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞    1.4.1  分組  取生長(zhǎng)良好的NSCs，機(jī)械反復(fù)輕柔吹打分散、200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾制備成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于4塊6孔培養(yǎng)板中，分別按感染復(fù)數(shù)（MOI）（v.g/cell）=0、1×104、1×105、1×1

17、06轉(zhuǎn)染，設(shè)四組，其中MOI=0作為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。    1.4.2  轉(zhuǎn)染  轉(zhuǎn)染時(shí)先按MOI值 計(jì)算 所需加入rAAV-2/EGFP病毒載體的體積數(shù)，在試管中將所需加入rAAV-2/EGFP病毒載體與DMEM/F12培養(yǎng)液混合形成轉(zhuǎn)染液，將每組對(duì)應(yīng)孔中加入相應(yīng)的2ml轉(zhuǎn)染液，MOI=0作為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，同樣操作但不轉(zhuǎn)染rAAV-2/EGFP，37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，1000r/min離心5min，如此DMEM/F12清洗細(xì)胞2次，棄病毒殘液，補(bǔ)充完全細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/F12加2

18、%B27，20ng/ml的EGF、bFGF）5ml，37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，常規(guī)換液、傳代。在倒置熒光顯微鏡下觀察、記錄rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs后EGFP的表達(dá)情況。    1.5  rAAV-2/EGFP體外轉(zhuǎn)染對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、分化的影響  rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs后，各組分別在7、14、21天細(xì)胞傳代時(shí)臺(tái)盼蘭拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算增殖倍數(shù)。0.2%臺(tái)盼蘭溶液與細(xì)胞懸液混勻，死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不著色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)及死細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞活力為活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)死細(xì)胞數(shù)）。EG

19、FP表達(dá)穩(wěn)定時(shí)，10胎牛血清誘導(dǎo)各組NSCs克隆球分化，觀察分化情況。    1.6  流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染率和表達(dá)效率7  rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs后，各組在各相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞機(jī)械反復(fù)輕柔吹打分散、200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀（BD），以未轉(zhuǎn)染組為對(duì)照，激發(fā)光為488nm、吸收光為530nm，進(jìn)行數(shù)據(jù)獲1 2 3  下一頁(yè)          

20、  取與 分析 ；分析結(jié)果用轉(zhuǎn)染率和熒光指數(shù)（fluorescent index，F(xiàn)I）表示。轉(zhuǎn)染率即EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性率，熒光指數(shù)主要反映了目的基因的表達(dá)效率。    每一樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞大小設(shè)定一個(gè)單細(xì)胞區(qū)域，該區(qū)域的細(xì)胞用于熒光分析。以未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，設(shè)定GFP陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)（M1區(qū)）使陰性對(duì)照M1區(qū)細(xì)胞數(shù)不超過(guò)0.1%，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果用轉(zhuǎn)染率和熒光指數(shù)FI表示。轉(zhuǎn)染率即為GFP陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性率，F(xiàn)I主要反映了目的基因的表達(dá)效率，分別用下列公式計(jì)算：轉(zhuǎn)染率=

21、樣品 M1區(qū)細(xì)胞百分率 陰性對(duì)照M1區(qū)細(xì)胞百分率；FI=樣品M1區(qū)細(xì)胞百分率樣品×M1區(qū)平均熒光強(qiáng)度  陰性對(duì)照 M1區(qū)細(xì)胞百分率×陰性對(duì)照M1區(qū)平均熒光強(qiáng)度。在上述兩個(gè)公式中，減數(shù)很小，一般情況下可忽略不計(jì)。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  各組數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。    2  結(jié)果 

22、0;  2.1  rAAV-2介導(dǎo)的EGFP基因在NSCs中的表達(dá)  rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs，10天后EGFP開(kāi)始表達(dá)，倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)各轉(zhuǎn)染組神經(jīng)球受藍(lán)色光激發(fā)產(chǎn)生的呈團(tuán)塊狀的綠色熒光，但較弱且強(qiáng)度不一，總體上感染復(fù)數(shù)越大熒光越強(qiáng)；隨后表達(dá)顯著增加，21天時(shí)達(dá)高峰，這時(shí)熒光較強(qiáng)（見(jiàn)圖2），表明細(xì)胞球中多數(shù)細(xì)胞被轉(zhuǎn)染并成功表達(dá)EGFP，細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，仍可見(jiàn)大量熒光。    22  rAAV-2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞活力、增殖、分化的影響  不同M

23、OI的rAAV-2轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的NSCs在倒置顯微鏡下觀察，均生長(zhǎng)良好，細(xì)胞透光性好，形態(tài)完整，細(xì)胞碎片少，NSCs形成克隆球速度相當(dāng)，細(xì)胞穩(wěn)定性好，可連續(xù)傳代，各組細(xì)胞在7、14、21天臺(tái)盼蘭拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力差異均無(wú)顯著性（P0.05）（見(jiàn)表1）。同時(shí)各組細(xì)胞在7，14，21天細(xì)胞計(jì)數(shù)從而計(jì)算增殖倍數(shù)，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)差異亦無(wú)顯著性（P0.05），并在培養(yǎng)過(guò)程中呈指數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)（見(jiàn)表2）。 表1  rAAV-2轉(zhuǎn)染對(duì)NSCs活力的影響注：均為同一時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組對(duì)照比較，組間比較P0.05，差異無(wú)顯著性表2  r

24、AAV-2轉(zhuǎn)染對(duì)NSCs增殖倍數(shù)的影響注: 均為同一時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，組間比較P0.05，差異無(wú)顯著性。    EGFP表達(dá)穩(wěn)定時(shí)，10胎牛血清誘導(dǎo)各組分化后，各組均可見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞克隆球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中6h左右細(xì)胞克隆球貼壁，12h后即發(fā)現(xiàn)有突起從團(tuán)塊邊緣長(zhǎng)出，24h后見(jiàn)有少數(shù)細(xì)胞從克隆球的邊緣向外遷移，分化為有突起的細(xì)胞，有的細(xì)胞遷移速度較快，以后分化的細(xì)胞逐漸增多，從克隆球周?chē)w移出，呈放射狀排列，隨著時(shí)間的推移，突起不斷增粗與延長(zhǎng)并互相連接成網(wǎng)狀，1周以后，各組NSCs克隆球幾乎完全分化，形成大量

25、胞體呈圓形或橢圓形、具有12細(xì)長(zhǎng)突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞和胞體較大、形態(tài)不規(guī)則、具有多個(gè)粗突起的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞。MAP-2、GFAP免疫熒光分別鑒定分化細(xì)胞，熒光顯微鏡下各組均可見(jiàn)MAP-2陽(yáng)性的神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。rAAV-2轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞不僅可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)保持正常，且轉(zhuǎn)染不影響神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例。各組MAP-2、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比例見(jiàn)表3，差異均無(wú)顯著性（P值均0.05）。表3  不同MOI轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組MAP-2、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比較注：組間比較P>0.05，差異無(wú)顯著性2.3  rAAV-2

26、對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率  EGFPEGFP開(kāi)始表達(dá)后，于14、21、28天流式細(xì)胞儀檢測(cè)各MOI的rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的效率（見(jiàn)表4）：可見(jiàn)21天為其表達(dá)高峰，此時(shí)MOI為1×104、1×105、1×106時(shí)轉(zhuǎn)染率分別為25.68%、50.60%、54.72%（見(jiàn)圖3），熒光指數(shù)（FI）分別為4.08、12.72、14.06。表4  不同MOI的rAAV-2/EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的效率中國(guó)論文聯(lián)盟    3  討論   &

27、#160;近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞的 研究 發(fā)展 迅速，但仍存在許多 問(wèn)題 ，如細(xì)胞移植時(shí)常常不能區(qū)別供體細(xì)胞與宿主細(xì)胞，不能較精確地觀察植入細(xì)胞的存活及生長(zhǎng)分化情況，也就難以對(duì)腦內(nèi)移植的功效作出一個(gè)客觀評(píng)價(jià)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們可根據(jù)不同的科研及 治療 目的，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行不同的遺傳學(xué)修飾，以期制成基因工程細(xì)胞，這些細(xì)胞極具科研和 應(yīng)用 價(jià)值，受到廣泛關(guān)注。病毒載體和非病毒載體是 目前 基因修飾中常用的兩大類(lèi)載體。非病毒載體有脂質(zhì)體、質(zhì)粒、分子偶聯(lián)載體等，基因轉(zhuǎn)移效率低。病毒載體應(yīng)用最廣泛，約占85%，其中腺相關(guān)病毒、逆（反）轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒是基因治療中最常用的4種病毒載體，病毒載體安全性問(wèn)題至關(guān)重要8。各種病毒載體都有自己