固相合成法制備環(huán)肽Hymenistatin1及其含statine的類似物

1、    固相合成法制備環(huán)肽Hymenistatin1及其含statine的類似物【摘要】  目的 研究固相合成法制備Hymenistatin1HS1，序列為cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle)及其statine類似物的工藝步驟和影響因素。方法 采用Fmoc或Boc保護(hù)氨基，以HBTU/NMM為縮合劑進(jìn)行直鏈肽接肽反應(yīng)、以BOP/HOBt/DIEA為縮合劑進(jìn)行環(huán)化固相合成HS1及其類似物。用色譜儀和質(zhì)譜儀對(duì)合成的環(huán)肽及其雜聚肽類似物進(jìn)行純化鑒定。結(jié)果 多肽合成收率可達(dá)65%，經(jīng)反相高效液相色譜(RPHPLC)柱

2、對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化后純度均達(dá)到90%以上，通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行質(zhì)譜儀(MALDIMS)檢測(cè)所合成的環(huán)肽及環(huán)肽類似物的分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量相符。結(jié)論 成功合成出了較高純度的目標(biāo)多肽化合物。 【關(guān)鍵詞】  固相多肽合成； HS1； Statine類似物； 純化ABSTRACT Objective Preparation of Hymenistatin1 HS1, cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle) and its four statineanalogues by solidphase peptide synthesis method,

3、and the synthesis process and influencing factors were investigated. Methods Using the Fmoc or Boc protected amino acids, HBTU/NMM as coupling reagent (linear peptide synthesis) and BOP/HOBt/DIEA as cyclizing reagent, the cyclooctapeptide HS1 and its analogues were synthesized. The target peptides w

4、ere purified by RPHPLC and identified by MALDIMS. Results The purity of the five peptides exceeded 90% and the yields up to 65%. The molecular weights of the synthesized peptides were identified by mass spectrogram. Conclusion The target peptide compounds with higher purity were synthesized.KEY WORD

5、S Solidphase Peptide Synthesis; HS1; Statineanalogues; PurificationHymenistatin1(HS1)是由Pettit等1從太平洋Hymeniacidon海綿中分離得到的一種環(huán)八肽。肽鏈序列為：cyclo(ProProTyrValProLeuIleIle)。有報(bào)道稱HS1在小鼠成淋巴細(xì)胞白血病P388的研究中具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但結(jié)果并沒有在后續(xù)的研究中得到充分證實(shí)2。Cebrat等3揭示了H1具有抑制體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫抑制作用。 Poojary等4合成的HS1顯示出對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，但對(duì)真菌的抑制作用不強(qiáng)；HS

6、1的驅(qū)蟲作用不大，但表現(xiàn)出一定的抗炎癥作用。Zubrzak等5用1，5二取代四唑環(huán)修飾HS1之后，修飾物的免疫抑制活性變化不大。Statine是羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCoA，膽固醇合成限速酶)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用和細(xì)胞效應(yīng)，且不依賴于血液膽固醇的降低。 有研究表明， statine不但可以抑制IFN刺激誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的MHCII抗原的表達(dá)6，還可以選擇性阻斷整合素2、白細(xì)胞功能抗原1(LFA1，即CD11a/CD18)的表達(dá)7。這些功能與statine對(duì)HMGCoA的抑制作用無關(guān)，提示statine也是一種潛在的免疫抑制劑。天然HS1的生物學(xué)活

7、性較弱，不能作為免疫抑制劑應(yīng)用。本文研究擬采用statine對(duì)HS1進(jìn)行修飾，以期能夠有效提高HS1的免疫抑制活性。天然HS1結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基都是疏水性氨基酸，并且是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，致使化學(xué)合成極其困難。為此，本文還希望通過修飾降低HS1的疏水性，提高HS1在水溶液中的溶解性。下面報(bào)道HS1及4個(gè)新化合物的設(shè)計(jì)、固相合成與分離純化方法。  1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 儀器與試劑多肽合成儀(CS536，美國(guó)CSBio公司)，半制備型高效液相色譜儀(Waters Delta Prep4000，美國(guó)Waters公司)，分析型高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)Agilent公司)

8、，冷凍干燥機(jī)(Christ Alpha，德國(guó)Christ公司)，激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LCQ Deca，美國(guó)ThermoFinnigan公司)，紫外分光光度計(jì)(Beckman DU7400，美國(guó)Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GPC18，5m，120，4.6mm×150mm)。實(shí)驗(yàn)所用FmocProMerrifield Resin(取代值0.291mmol/g，交聯(lián)度1%，100200目)、BocValWang Resin(取代值0.523mmol/g，交聯(lián)度1%，100200目)、FmocProCTC Resin(取代值0.42mmol/g，交聯(lián)度1%，1

9、00200目)、BocTyr(tBu)OH、BocProOH、BocIleOH、BocLeuOH、FmocTyr(tBu)OH、FmocProOH、FmocIleOH、FmocLeuOH、Bocstatine(3s，4s)OH、HATUO(7偶氮苯并三氮唑1氧)N，N，N，N四甲基脲六氟磷酸酯、HBTU(苯并三唑1四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N羥基苯并三唑)、BOP(鄰苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N二異丙基乙胺;二異丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亞砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、NMM(N甲基

10、嗎啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶經(jīng)重蒸后使用，水為二次去離子水。1.2 HS1及其類似物的化學(xué)合成本文所合成的5種環(huán)肽序列分別為：HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7Leu8)；A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6Pro7Leu8)；A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6Pro7Leu8)；A3HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6statine7Leu8)；A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3stat

11、ine4Tyr5Val6Pro7Leu8)。雖然這5種環(huán)肽或環(huán)肽類似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照順序給每個(gè)氨基酸殘基做了編號(hào)，但考慮到每個(gè)化合物的疏水性和空間位阻可能并不完全相同，加之合成的線性肽鏈終究要環(huán)化成環(huán)肽，因此，為了方便、有效地合成目的產(chǎn)物，我們選擇接肽反應(yīng)的第一個(gè)氨基酸也不盡相同。(1)HS1的合成路線與純化樹脂溶脹 調(diào)用自編程序Method1，樹脂溶脹的具體方法是將FmocProCTC Resin 4.76g(合成規(guī)模為2.0mmol)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶脹，然后抽干。脫除氨基保護(hù)基 調(diào)用自編程序Method2，具體方法為加入含20%哌啶的D

12、MF溶液20ml，攪拌反應(yīng)30min，再抽干。然后用DMF洗滌5次，以除去殘留的脫保護(hù)試劑。手工取樣，茚三酮檢測(cè)，若樹脂呈深藍(lán)色，則表明Fmoc保護(hù)基已經(jīng)脫除。接肽反應(yīng) 調(diào)用自編程序Method3，具體方法是在反應(yīng)器中加入溶解有3.33g FmocValOH的200ml DMF溶液，機(jī)械攪拌2min，然后加入HBTU 3.57g，最后加入NMM 2.02gAAHBTUNMM(mol/mol)=32.856，反應(yīng)30min。抽干，用DMF洗滌3次，然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工進(jìn)行茚三酮檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果若樹脂呈現(xiàn)無色，則說明反應(yīng)比較完全。依次調(diào)用程序Method2和Meth

13、od3，按肽鏈的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH、FmocProOH、FmocProOH等重復(fù)以上接肽反應(yīng)，直至最終合成出所需肽鏈。合成順序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu。各氨基酸的投料比、接肽反應(yīng)時(shí)間和脫保護(hù)基時(shí)間如表1所示。后續(xù)類似物的合成中，表1所列參數(shù)基本不變。BocstatineOH的投料比為2，接肽反應(yīng)時(shí)間為40min，脫保護(hù)基時(shí)間為30min。肽鏈的切割 將合成肽鏈用切割液TFATIS(triisopropylsilane)H2O=95.02.52.5在低于20的條件下切割，反應(yīng)時(shí)間為2.5h，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀

14、溶解在切割液中的多肽，4000表1 HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反應(yīng)時(shí)間r/min離心3min，真空干燥12h，得線性肽鏈的粗品約1.5g。肽鏈的環(huán)化 將線性多肽粗品1.4g用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和DIEA(5eq，1.1g)，過夜環(huán)化。加入EDC可以加速縮合反應(yīng)。蒸干DMF，得環(huán)肽粗品1.35g，粗品用MALDITOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒定。環(huán)肽粗品的純化 將上述環(huán)化粗品肽溶于適量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上樣濃度要嚴(yán)格控制在小于1mg/ml)，上樣樣品用5m的濾紙過濾。制備色譜柱為Wa

15、ters XBridge C18、5m反相柱；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。采用60min內(nèi)B液由30%65%的線性梯度洗脫方式，流速為38ml/min。收集純度高于95%的餾分。最后冷凍干燥，得100mg純度大于90%的最終產(chǎn)品。分析型HPLC檢測(cè)純度 色譜柱為SepaxGPC18反相柱(4.6mm×150mm，5m，120)；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。采用20min內(nèi)B液由60%80%的線性梯度洗脫方式，流速為1.0ml/min。MS鑒定 激

16、光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的分子量。(2)A1HS1的合成路線與純化 與HS1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下幾點(diǎn)變化：樹脂改為FmocProMerrifield Resin；氨基酸為Boc保護(hù)；每連接一個(gè)氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM將肽鏈切割下來，然后脫保護(hù)、洗滌、活化樹脂，再連下一個(gè)氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來的切割液為HF，時(shí)間1.2h；純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：70%100%；HPLC分析時(shí)B液：61%81%；合成順序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS1合成。冷凍干燥后得250mg

17、純度大于93%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。(3)A2HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A2HS1合成中：樹脂為FmocProCTC Resin；氨基酸為Fmoc保護(hù)；最后切割液為F液，時(shí)間2.5h；純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：65%90%；HPLC分析時(shí)B液：60%80%；合成順序?yàn)椋篜ro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；因statine是用Boc保護(hù)，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護(hù)、洗滌、樹脂活化，再連下一個(gè)殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得268mg純度大于92

18、%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。(4)A3HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A3HS1合成中：樹脂為FmocValWang Resin；氨基酸為Fmoc保護(hù)；切割液為F液，時(shí)間2.5h；純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：43%85%；HPLC分析時(shí)B液：50%70%；合成順序?yàn)椋篤al，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；因statine是用Boc保護(hù)，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護(hù)、洗滌、樹脂活化，再連下一個(gè)殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得245mg純度大于98%的最終產(chǎn)品。

19、由于溶解度比HS1好，故收率較高。(5)A4HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A4HS1合成中：樹脂為FmocProMerrifield Resin；氨基酸為Boc保護(hù)；每連接一個(gè)氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗滌，再連下一個(gè)氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來，切割液為HF，時(shí)間1.2h；純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：62%80%；HPLC分析時(shí)B液：62%82%；合成順序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；因statine是用Boc保護(hù)，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切

20、割下來，然后脫保護(hù)、洗滌、樹脂活化，再連下一個(gè)殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得215mg純度大于90%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。  2 結(jié)果與討論 2.1 目標(biāo)產(chǎn)物的合成(1)環(huán)肽的代謝穩(wěn)定性和生物利用度一般遠(yuǎn)高于直鏈肽8，但環(huán)肽的化學(xué)合成往往比較困難，尤其是首尾相連的環(huán)肽合成難度更大。本試驗(yàn)研究的5種肽或雜聚肽都是首尾相接的環(huán)肽，而且8個(gè)氨基酸殘基都是疏水性氨基酸，給合成造成困難，也使得純化更加不易。(2)常規(guī)的固相合成中需要特殊的固相支持物。當(dāng)用普通的Fmoc固相支持物時(shí)，在二肽階段，由于環(huán)化引起的損失非常高，有些情況甚至導(dǎo)致所有肽鏈從固相支持物

21、上損失，特別是若C端為氨基化Pro時(shí)。但Boc法則可以避免這類副反應(yīng)。因此本研究中所采用的幾種不同的樹脂，即當(dāng)C端為氨基化Pro時(shí)，采用Merrifield Resin，C端為其它氨基化氨基酸時(shí)，采用Wang Resin和CTC Resin。選擇具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)、足夠多的反應(yīng)位點(diǎn)及副反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)的樹脂，可以提高產(chǎn)物收率，降低純化成本。(3)本研究以HBTU/NMM(合成線性肽鏈)和BOP/HOBt/DIEA(環(huán)化時(shí))作為復(fù)合型縮合試劑，NMH或DIEA提供反應(yīng)所需堿性環(huán)境(后者堿性強(qiáng)于前者)。加入5倍量的DIEA目的是加快縮合速率，并提高產(chǎn)品收率。2.2 合成肽的純化及純化后的色譜分析純化時(shí)

22、以TFA為交換離子對(duì)、以含0.1% TFA的乙腈水溶液為洗脫液、采用線性梯度洗脫方式對(duì)目標(biāo)肽進(jìn)行純化。純化后的色譜分析結(jié)果顯示，主峰面積較大，主峰旁無相似的峰，其它雜質(zhì)峰面積相比于主峰面積要小得多，表明合成的粗品經(jīng)反相高效液相色譜純化后，目標(biāo)肽的純度得到了很大地提高(圖略)。2.3 合成肽純化后的質(zhì)譜鑒定MALDIMS分析的結(jié)果顯示，HS1、A4HS1的實(shí)際分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量相一致。A1HS1、A2HS1和A3HS1的實(shí)際分子量數(shù)值比理論 計(jì)算 值高一個(gè)單位，可能由于純化過程中使用了TFA，肽能與TFA成鹽造成。另外，質(zhì)譜圖中峰數(shù)較少，且主峰明顯，說明合成的目標(biāo)肽經(jīng)色譜柱純化后，可以除去大

23、部分的雜質(zhì)，從而得到較純的目標(biāo)肽(圖略)。本研究中合成的5種肽分子量及純度見表2。  3 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)采用固相合成法制備HS1及含statine的4種類似物，經(jīng)質(zhì)譜儀分析檢測(cè)，驗(yàn)證了合成產(chǎn)物的正確性。產(chǎn)物經(jīng)RPHPLC純化，純度均達(dá)到90%以上，表2 本文合成的HS1及其類似物MS檢測(cè)的分子量及純度產(chǎn)品理化性質(zhì)穩(wěn)定，為下一步生物活性檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。【 參考  文獻(xiàn) 】 1 Pettit G R, Clewlow P W, Dufresne C, et al. Isolation and structure of the cyclic peptide hy

24、menistatin I J. Can J Chem,1990,68(5):708711.2 Konat R K, Mierke D F, Kessler H, et al. Synthesis and solvent effects on the conformation of hymenistatin I J. Helv Chim Acta,1993,76(4):16491666.3 Cebrat M, Wieczorek Z, Siemion I Z. Immunosuppressive activity of hymenistatin I J. Peptides,1996,17(2):191196.4 Poojary B, Belagali S L. Synthetic studies on cyclic octapeptides: Yunnanin F and Hymenistatin J. Eur J Med Chem,200