大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、CCK受體的表達(dá)及慢性嗎啡作用對(duì)其表達(dá)的影響(1)

1、    大鼠海馬神經(jīng)元中阿片受體、CCK受體的表達(dá)及慢性嗎啡作用對(duì)其表達(dá)的影響(1)    】 目的: 研究MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的分布和嗎啡對(duì)其受體的影響. 方法：用激光共聚焦掃描技術(shù)，以神經(jīng)元特異性標(biāo)記抗體NF200對(duì)原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，采用特異性的MOR1，CCKAR，CCKBR的抗體觀察觀察它們?cè)诤ｑR神經(jīng)元上的表達(dá). 選用雄性Wister大鼠，用劑量遞增法皮下注射鹽酸嗎啡，對(duì)照組以同樣的方法給予生理鹽水后，取出大鼠海馬組織用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間嗎啡作用于海馬神經(jīng)元時(shí)上述受體的表

2、達(dá). 結(jié)果: 海馬神經(jīng)元上同時(shí)表達(dá)MOR1，CCKAR及CCKBR；給予嗎啡后24 d，MOR1在海馬神經(jīng)元上的表達(dá)較對(duì)照增高(P<0.05)，5 d時(shí)，MOR1的表達(dá)顯著下降(P<0.01)；隨嗎啡作用時(shí)間延長(zhǎng)，CCKAR和CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，且CCKBR的表達(dá)高于CCKAR (P<0.01). 結(jié)論：海馬神經(jīng)元上同時(shí)存在MOR1，CCKAR和CCKBR，嗎啡作用時(shí)間越長(zhǎng)，MOR1表達(dá)越弱，而CCKAR和CCKBR表達(dá)越強(qiáng). 【關(guān)鍵詞】 阿片受體； CCKA受體；CCKB受體；嗎啡依賴(lài)；原代海馬神經(jīng)元；激光共聚焦；流式細(xì)胞術(shù)0引言研究表明受體（MOR1）

3、是嗎啡等阿片類(lèi)物質(zhì)的主作用位點(diǎn)，鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng)，成癮性也最強(qiáng)1-2. 另有實(shí)驗(yàn)研究表明：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布著一種典型的腦腸肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide, CCK)，它是腦內(nèi)含量最高的一種神經(jīng)肽3，其通過(guò)CCK受體發(fā)揮生理作用. 實(shí)驗(yàn)已證實(shí)：CCK受體拮抗劑不但能針對(duì)戒斷癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，而且有一定程度的防止復(fù)吸作用4，但具體機(jī)制尚未完全闡明. 本研究采用不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，重點(diǎn)闡明MOR1, CCKAR及CCKBR是否存在于海馬神經(jīng)元上以及嗎啡在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)3種受體的影響，為進(jìn)一步研究CCK受體拮抗劑對(duì)嗎啡依賴(lài)大鼠戒斷癥狀的影響及其機(jī)制的研究奠定必的基

4、礎(chǔ).1材料和方法1.1材料健康雄性Wistar大鼠，二級(jí)動(dòng)物，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：冀醫(yī)動(dòng)字第602054）. 鹽酸嗎啡(morphine hydrochloride，MOR)，沈陽(yáng)第一制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：遼寧藥準(zhǔn)字(1996)第002747號(hào). DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal Medium，B27 (美國(guó)Gibco公司)；山羊抗CCKA，山羊抗CCKB抗體，兔抗MOR1多克隆抗體，F(xiàn)ITCdonkey antimouse IgG，Biotindonkey antirabbit IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)；TRITCrabbit antigoat IgG，F(xiàn)ITC

5、rabbit antigoat IgG， FITCgoat antirabbit IgG(北京中山生物公司)；CY5antirabbit IgG(Camical公司)；小鼠抗NF200單克隆抗體(NEO MARKERS公司)；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica)；EpicsXL流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter).1.2方法1.2.1原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)取出生1 d的大鼠在無(wú)菌條件下分離海馬組織，制備細(xì)胞懸液，用含B27 Supplement的NBM進(jìn)行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng).1.2.2神經(jīng)元鑒定取培養(yǎng)6 d的

6、大鼠海馬神經(jīng)元，用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行鑒定，一抗分別為GFAP多克隆抗體和NF200單隆抗體，二抗分別為Biotindonkey antirabbit IgGCY5antidonkey IgG和FITCdonkey antimouse IgG，標(biāo)記后選擇不同視野細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦掃描40（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）.1.2.3MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá)將原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為NF200/MOR1，NF200/CCKAR，NF200/CCKBR 3組，特異性抗體同上，用免疫熒光標(biāo)記和激光共聚焦掃描技術(shù)檢測(cè)受體的表達(dá).1.2.4MOR1，CCKAR，CCK

7、BR在嗎啡處理大鼠海馬神經(jīng)元的表達(dá)1.2.4.1給藥與分組60只健康雄性Wistar隨機(jī)分為對(duì)照組（control），M1M9組（分別給予MOR 19 d），大鼠參照文獻(xiàn)5以劑量遞增法背部皮下給予嗎啡，首日嗎啡20 mg/kg，分2次皮下注射(8:00, 18:00). 以后每日增加20 mg/kg，9 d 8:00末次注射嗎啡1 h后取大鼠海馬. 每組n=6.1.2.4.2大鼠海馬神經(jīng)元的分離及檢測(cè)9 d 08:00末次注射嗎啡1 h，按照本實(shí)驗(yàn)室方法分離海馬6，制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性大于95. 無(wú)血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL， 用流式細(xì)胞儀隨機(jī)測(cè)定單個(gè)

8、細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm， 發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）. 每份標(biāo)本10 000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值為測(cè)定值， 用以反映受體蛋白表達(dá).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示. 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. 各組均數(shù)的比較采用Dunnettt檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，將CCKAR與CCKBR作為整組采用配對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)兩組間進(jìn)行比較， P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果2.1體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的鑒定結(jié)果顯示：NF陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光，GFAP標(biāo)記藍(lán)色熒光，在整張蓋片，NF陽(yáng)性細(xì)胞90以上，同時(shí)有散在的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(圖1).   

9、60;2.2MOR1, CCKAR及CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá)在海馬神經(jīng)元膜，軸突和樹(shù)突上均有發(fā)藍(lán)色熒光的MOR1陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物（圖2A，D）；綠色熒光標(biāo)記物與紅色熒光標(biāo)記物重疊之后呈橙黃色熒光，CCKA, CCKB受體呈橙黃色標(biāo)記,在海馬神經(jīng)元膜表面廣泛分布（圖2B，C，E，F(xiàn)）.2.3嗎啡對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元MOR1, CCKAR, CCKBR表達(dá)的影響采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)給予嗎啡后MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元上的表達(dá). 給予嗎啡2 d時(shí)MOR1上調(diào)(P<0.05)，5 d時(shí) MOR1開(kāi)始出現(xiàn)下調(diào)，蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，并呈時(shí)間依賴(lài)性. 給藥2 d，C

10、CKB受體的熒光強(qiáng)度值較對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05). 給藥5 d，CCKA受體的熒光強(qiáng)度值較對(duì)照組顯著升高(P<0.01，表1). 同一時(shí)間點(diǎn)CCKB受體的熒光值高于CCKA受體(P<0.01，表1).表1嗎啡對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元MOR1, CCKB和CCKA受體表達(dá)的影響(略)3討論阿片類(lèi)物質(zhì)長(zhǎng)期作用會(huì)引起細(xì)胞的一些適應(yīng)性改變，如阿片受體下調(diào)、內(nèi)吞以及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的上調(diào)等，可能與阿片耐受和依賴(lài)的形成有關(guān)7. 受體介導(dǎo)了嗎啡的身體依賴(lài)性和精神依賴(lài)性8. 在嗎啡依賴(lài)狀態(tài)下，海馬、紋狀體、丘腦、下丘腦的受體特異性結(jié)合密度發(fā)生非常顯著下降9-10. 本實(shí)驗(yàn)

11、選擇海馬為靶區(qū)，模擬自然嗎啡依賴(lài)形成過(guò)程，來(lái)觀察受體的變化. 結(jié)果顯示受體（MOR1）存在于海馬神經(jīng)元的細(xì)胞膜、軸突及樹(shù)突膜上. 這與已有的研究結(jié)果類(lèi)似11，其機(jī)制可能是由于受體磷酸化和去磷酸化反應(yīng)之間的失衡所致受體基因表達(dá)下降或膜上受體發(fā)生內(nèi)吞.            【摘】目的: 研究MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的分布和嗎啡對(duì)其受體的影響. 方法：用激光共聚焦掃描技術(shù)       

12、60; 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。    CCK是腦內(nèi)含量最高的一種神經(jīng)肽12，其作用與阿片受體拮抗劑不同，它不是直接阻斷阿片受體，而是激活CCK受體，使阿片受體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，與阿片的結(jié)合力降低. 該研究說(shuō)明CCK受體與阿片受體直接對(duì)話. 連續(xù)注射嗎啡6 d，使大鼠多數(shù)腦區(qū)CCK8含量升高，CCK mRNA含量顯著增高13. Blandine等14證實(shí)，CCKB受體的缺失可以導(dǎo)致內(nèi)源性阿片

13、肽的增量調(diào)節(jié). CCK8可能參與嗎啡依賴(lài)的形成. 但不同時(shí)間點(diǎn)嗎啡對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元CCK受體的影響報(bào)道甚少，為此我們通過(guò)LSCM觀察了CCKA和CCKB受體在海馬神經(jīng)元上的表達(dá)，并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)嗎啡作用下CCKA和CCKB受體在不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá). 證實(shí)CCKA，CCKB受體廣泛存在于神經(jīng)元的細(xì)胞膜、軸突及樹(shù)突膜上，而且表達(dá)量很高. 且海馬神經(jīng)元以CCKB受體為主. CCK8作為很強(qiáng)的內(nèi)源性抗阿片肽，在阿片介導(dǎo)的疼痛、耐受及成癮中起到了非常重的作用. CCK受體可與阿片受體直接作用或通過(guò)受體后機(jī)制相互影響. 但阿片受體與CCK受體之間存在何種相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1Wan

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