代謝工程ppt課件

1、第六章第六章 代謝工程代謝工程分子和基因技術(shù)開展促成的，提供了全新的合成方法代謝工程概述代謝工程概述細(xì)胞的生命活動(dòng)是經(jīng)過活細(xì)胞和細(xì)胞群的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)展的，而代謝網(wǎng)絡(luò)是由一系列酶的級(jí)聯(lián)化學(xué)反響以特異性的膜轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)成。對(duì)人類的運(yùn)用而言，活細(xì)胞本身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)的遺傳特性并不是最正確的，為了積累大量的某種代謝產(chǎn)物，就必需求突破并重建細(xì)胞的代謝平衡。代謝工程是指在全面了解細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)制的根底上，采用基因工程手段改動(dòng)細(xì)胞代謝系統(tǒng)的關(guān)鍵途徑或引入新的反響，從而定向改良產(chǎn)物的生成或者是合成新產(chǎn)品。代謝工程建立在多學(xué)科根底之上，也需求不同角度的結(jié)合研討。代謝工程的組成：一是研討生物代謝途徑的控制戰(zhàn)略

2、；二是經(jīng)過生物加工技術(shù)在生物體上實(shí)現(xiàn)代謝設(shè)計(jì)戰(zhàn)略。在代謝工程設(shè)計(jì)中，主要有改動(dòng)代謝流、擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑三種。改動(dòng)代謝途徑改動(dòng)代謝途徑改動(dòng)代謝途徑是指改動(dòng)分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝產(chǎn)物的合成，以到達(dá)提高目的產(chǎn)物的目的。改動(dòng)代謝途徑有多種方法，如加速限速反響、改動(dòng)分支代謝途徑流向、構(gòu)建代謝旁路、改動(dòng)能量代謝途徑等。實(shí)例實(shí)例最勝利的一個(gè)例子是頭孢霉素C的代謝工程菌的構(gòu)建，頭孢霉素C的合成途徑。青霉素N是頭孢霉素合成的中間體。當(dāng)用頂頭孢發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)了青霉素N的積累，這闡明下一步酶反響是頭孢霉素合成代謝中的限速步驟。因此克隆了編碼脫乙酰氧基頭孢霉素C合成酶基因cefEF，并導(dǎo)入頂頭孢

3、中，所得轉(zhuǎn)化子的頭孢霉素C產(chǎn)量提高了25，而青霉素N的積累量減少至原來的1/16。 頭孢霉素頭孢霉素C C的代謝工程菌的構(gòu)的代謝工程菌的構(gòu)建建 改動(dòng)分支代謝途徑流向改動(dòng)分支代謝途徑流向改動(dòng)分支代謝途徑流向是指提高代謝分支點(diǎn)的某一代謝途徑酶系的活性，在與另外的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，亦可提高目的末端代謝產(chǎn)物的的產(chǎn)量。如：賴氨酸合成，選育解除反響抑制和缺失高絲氨酸脫氫酶的突變株，提高了賴氨酸的產(chǎn)量。而為了獲得蘇氨酸的高產(chǎn)菌株，以解除了反響抑制的賴氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌為宿主，轉(zhuǎn)入高絲氨酸脫氫酶基因，結(jié)果使原來不產(chǎn)生蘇氨酸的賴氨酸產(chǎn)生菌的賴氨酸產(chǎn)量由65g/L下降至4g/L，而蘇氨酸產(chǎn)量添加到52

4、g/L，使賴氨酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌。高絲氨酸脫氫酶基因賴氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌產(chǎn)生菌的賴氨酸產(chǎn)量由產(chǎn)生菌的賴氨酸產(chǎn)量由65g/L65g/L下降至下降至4g/L4g/L，蘇氨酸產(chǎn)量添加到蘇氨酸產(chǎn)量添加到52g/L52g/L，賴氨酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌。賴氨酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌。擴(kuò)展代謝途徑擴(kuò)展代謝途徑定義：指在引入外援基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端產(chǎn)物?；蚴乖瓉淼拇x途徑向前延伸，可以利用新的原料合成代謝產(chǎn)物。轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑指將催化一系列反響的多個(gè)酶基因，克隆到不能產(chǎn)生某種新的化學(xué)構(gòu)造的代謝產(chǎn)物的微生物中，使之獲得產(chǎn)生新的化合物的才干；或

5、利用基因工程手段，克隆少數(shù)基因，使細(xì)胞原有無關(guān)的兩條代謝途徑結(jié)合起來，構(gòu)成新的途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物；或?qū)⒋呋骋淮x途徑的基因組克隆到另一位生物中，使之發(fā)生代謝轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生目的產(chǎn)物。代謝工程根本過程代謝工程根本過程代謝工程的運(yùn)用代謝工程的運(yùn)用提高微生物轉(zhuǎn)化的目的產(chǎn)物得率、產(chǎn)率或消費(fèi)強(qiáng)度經(jīng)過基因改造合成原細(xì)胞無法得到的新產(chǎn)物藥物合成細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研討代謝網(wǎng)絡(luò)實(shí)際代謝網(wǎng)絡(luò)實(shí)際代謝網(wǎng)絡(luò)實(shí)際把細(xì)胞的生化反響以網(wǎng)絡(luò)整體而不是孤立地思索。細(xì)胞代謝的網(wǎng)絡(luò)由上萬種酶催化的系列反響系統(tǒng)、膜傳送系統(tǒng)、信號(hào)傳送系統(tǒng)組成，并且既受精細(xì)調(diào)理，又彼此相互協(xié)調(diào)。各種代謝都不是孤立進(jìn)展的，而是相互作用、相互轉(zhuǎn)化、相互制約

6、的一套完好、一致、靈敏的調(diào)理系統(tǒng)。節(jié)點(diǎn)節(jié)點(diǎn)柔性節(jié)點(diǎn)：是指由節(jié)點(diǎn)流向各分支的代謝流量分割率隨代謝要求發(fā)生相應(yīng)的變化，去除產(chǎn)物的反響抑制后，該分支的代謝流量分割率大大添加。強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)：是指由節(jié)點(diǎn)流向某一分支或某些分支的代謝流量分割率是難以改動(dòng)的，這是由產(chǎn)物的反響抑制及對(duì)另一分支酶的反式激活的相互作用所致。弱剛性節(jié)點(diǎn)：是指介于前兩者之間，由該節(jié)點(diǎn)流向各分支的代謝流中有一個(gè)是占主導(dǎo)位置的，其酶活較高或?qū)?jié)點(diǎn)代謝的親和力較大，且無反響抑制，經(jīng)過減弱主導(dǎo)分支的酶量或酶活可添加產(chǎn)物的產(chǎn)率。柔性及弱剛性節(jié)點(diǎn)是代謝設(shè)計(jì)的主要對(duì)象假設(shè)代謝網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)同等重要，即對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量具有相近的影響，那么這類代謝網(wǎng)絡(luò)稱為依賴

7、型代謝網(wǎng)絡(luò)。依賴型代謝網(wǎng)絡(luò)的存在會(huì)給代謝工程的實(shí)施帶來很大的困難。假設(shè)代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中，那么可以經(jīng)過對(duì)代謝的修飾影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，這類網(wǎng)絡(luò)為獨(dú)立型網(wǎng)絡(luò)。普通以為，只需少數(shù)分支點(diǎn)處的通量分配比實(shí)踐影響著產(chǎn)品得率。代謝通量分析代謝通量分析1 黑箱模型 黑箱模型就是將胞內(nèi)反響看成是單一反響或者是整個(gè)細(xì)胞生物基質(zhì)的變化，并采用物料衡算原理保證細(xì)胞內(nèi)外各元素之間的平衡。在此模型中涉及的元素包括底物、代謝產(chǎn)物和生物基質(zhì)的元素組成及其一系列進(jìn)出細(xì)胞的流量。細(xì)胞2 代謝流平衡模型 在黑箱模型的根底上結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)圖，便提出了代謝流平衡模型。根據(jù)代謝途徑中各反響的計(jì)量關(guān)系以及實(shí)驗(yàn)的某些底物、產(chǎn)物的通量及細(xì)

8、胞組成等確定整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分布。 要得到正確的通量分布，必需清楚地了解細(xì)胞內(nèi)代謝途徑，尤其是各個(gè)分支點(diǎn)。短少某一重要的分支或添加某一根本不存在的分支，都能夠使求得的通量分布有很大變化。計(jì)算代謝物質(zhì)量平衡的化學(xué)計(jì)量方程為：代謝通量分析的運(yùn)用代謝通量分析的運(yùn)用確定胞內(nèi)代謝途徑中各支路的通量分布，確定途徑分支點(diǎn)上的通量分配比，判別胞內(nèi)物質(zhì)的代謝流向。識(shí)別胞內(nèi)能否存在某條代謝途徑預(yù)測(cè)未丈量的胞外通量計(jì)算最大實(shí)際得率代謝通量丈量技術(shù)代謝通量丈量技術(shù)丈量方法的中心是利用同位素標(biāo)志根據(jù)代謝物標(biāo)志強(qiáng)度直接確定物流平衡與同位素標(biāo)志代謝物相結(jié)合碳平衡分析結(jié)合同位素標(biāo)志實(shí)驗(yàn)實(shí)例實(shí)例甘油代謝途徑最大實(shí)際得率計(jì)算厭

9、氧發(fā)酵微氧發(fā)酵甘油1,3-丙二醇代謝控制分析代謝控制分析目的在于將代謝系統(tǒng)的變量同其參數(shù)聯(lián)絡(luò)起來，可以確定代謝通量對(duì)酶活性的敏感性。通量控制系數(shù)濃度控制系數(shù)彈性系數(shù)代謝調(diào)控機(jī)理代謝調(diào)控機(jī)理經(jīng)過調(diào)理酶、底物、代謝物等的濃度或活性可以對(duì)代謝途徑進(jìn)展調(diào)控，該行為可以發(fā)生在多個(gè)程度。代謝調(diào)控最普遍的方式是酶活性的調(diào)理代謝工程是要經(jīng)過改動(dòng)分支點(diǎn)的通量分配來提高產(chǎn)率通量控制系數(shù)確實(shí)定方法通量控制系數(shù)確實(shí)定方法直接法間接法經(jīng)過瞬變代謝物的丈量根據(jù)動(dòng)力學(xué)模型直接計(jì)算根據(jù)大偏向?qū)嶋H計(jì)算代謝網(wǎng)絡(luò)的控制分析代謝網(wǎng)絡(luò)的控制分析組控制系數(shù)不同溶解氧條件下代謝網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)谷氨酸濃度的預(yù)測(cè)性能 實(shí)線：在線推定的結(jié)果利用代謝網(wǎng)絡(luò)模型的在線形狀預(yù)測(cè)和利用代謝網(wǎng)絡(luò)模型的在線形狀預(yù)測(cè)和控制控制利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)改良優(yōu)選代利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)改良