二氮嗪對(duì)深低溫腦缺血再灌注大鼠腦組織NR1表達(dá)的影響(1)

1、    二氮嗪對(duì)深低溫腦缺血再灌注大鼠腦組織NR1表達(dá)的影響(1)    】 目的 探討二氮嗪對(duì)深低溫缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法制作 深低溫缺血再灌注大鼠模型，將306只SD大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組、二氮嗪組和模型組。分別在缺血1 h后再灌注2、6、12h及1、2、3、7 d斷頭取腦，對(duì)腦組織行含水量檢測(cè)，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)腦組織NR1表達(dá)情況。 結(jié)果 假手術(shù)組腦組織含水量明顯低于二氮嗪組和模型組，二氮嗪組低于模型組，模型組和二氮嗪組腦組織含水量在12h開(kāi)始升高、1

2、d達(dá)高峰、3d基本恢復(fù)正常，模型組和二氮嗪組NR1均在2h開(kāi)始升高、1d達(dá)到高峰、7d后基本達(dá)到正常水平，但二氮嗪組NR1表達(dá)水平在2、6、12h及1、2d明顯低于模型組，且兩組NR1表達(dá)水平均高于假手術(shù)組。 結(jié)論 二氮嗪預(yù)處理對(duì)深低溫缺血再灌注大鼠具有腦保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)腦組織NR1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。 【關(guān)鍵詞】 深低溫;腦缺血再灌注;二氮嗪;腦保護(hù);NR1表達(dá);大鼠腦缺血再灌注損傷及其機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚不完全清楚。腦缺血再灌注損傷包括神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋 亡兩個(gè)方面，其中線粒體ATP敏感性鉀通道被認(rèn)為是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一1。二氮嗪是線粒體ATP依賴性鉀離子通道開(kāi)放劑，已廣泛應(yīng)用于缺血再

3、灌注心肌保護(hù)方面的研究，而對(duì)腦保護(hù)方面的研究相對(duì)較少。N-甲基天冬氨酸受體（NMDAR）是目前研究最為深入的興奮 性氨基酸（EAA）受體之一，是一種離子型EAA受體。目前已證實(shí)，NMDAR是由NR1、NR2A2D 5種亞單位組成的異聚體。其中NR1亞單位是NMDAR的功 能單位，NR2是其調(diào)節(jié)單位，只有和NR1組合才表現(xiàn)出活性。NR1基因紊亂就會(huì)使NMDAR的活性喪失。EAA的毒性是通過(guò)受體活性改變而發(fā)揮作用，缺氧缺血能影響NMDAR的數(shù)量和功能，誘導(dǎo)和加強(qiáng)NR1 的表達(dá)，上調(diào)NMDAR的數(shù)量。基于上述研究背景，本試驗(yàn)主采用腦缺血再灌注大鼠模型，觀察二氮嗪預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦含水量、形

4、態(tài)學(xué)及NR1的表達(dá)變化來(lái)探討二氮嗪對(duì)深低溫缺血再灌注大鼠是否具有腦保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。 1 材料和方法    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，體重200 250 g，由南京市兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼 養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)均符合我國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施 細(xì)則（1998）的求。 1.2 主儀器與試劑 水合氯醛（南京市兒童醫(yī)院提供）、二氮嗪（美國(guó)Sigma公司）、NR1（Santa Cruz公司），羊抗兔即用型 SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒SA1022（武漢博士德公司）、DAB顯色劑（武漢博士德公司）、多聚賴氨酸（美國(guó)Sigma公司）

5、、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、熒光倒置顯微鏡（德國(guó)蔡司）、801圖像分析 系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)）。 1.3 動(dòng)物模型建立 用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及頭部。剃除頸部及腹股溝處鼠毛，碘伏消毒皮膚，酒精脫碘后，縱行剪開(kāi)頸部皮膚，從正中打開(kāi)頸外肌層，分別向左右沿頸外斜肌間隙分離筋膜，找到頸總動(dòng)脈，從伴行的神經(jīng)旁游離出動(dòng)脈并套上絲線，用紗布蓋好切口;用涂有石蠟油的溫度計(jì)插入肛門(mén)3cm ，探測(cè)大鼠的體溫（通過(guò)對(duì)大鼠深部體溫檢測(cè)來(lái)估計(jì)腦部的溫度）。將鼠置冰盒并用冰塊袋包埋大鼠行物理降溫。當(dāng)體溫降至21時(shí)停止降溫，用動(dòng)脈夾阻 斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈，使體溫維持在（21±

6、1） ，60min 后恢復(fù)頸總動(dòng)脈血流。用電吹風(fēng)給大鼠復(fù)溫，每分鐘體 溫恢復(fù)不超過(guò)0.5，大約在0.5h內(nèi)將體溫恢復(fù)到32，再將大鼠放入35早產(chǎn)兒孵育箱復(fù)溫，在2h內(nèi)將體溫恢復(fù)到37.5 體溫，維持正常體溫4h后放置室溫下正常飼養(yǎng)。 1.4 動(dòng)物分組 假手術(shù)組:102只，不夾閉左右頸總動(dòng)脈，不注 射藥物;模型組:102只，術(shù)前腹腔內(nèi)注射等體積生理鹽水;二氮嗪組:102只，術(shù)前腹腔內(nèi)注射二氮嗪5mg · kg-1。模型組和二氮嗪組再分為缺血60 min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7個(gè)小組，假手術(shù)組分為術(shù)后2、6、12 h和1、2、3、7d共7個(gè)小組，每個(gè)小組 16只，其中

7、6只用于腦組織含水量測(cè)定，10只用于石 蠟包埋后行免疫組化檢測(cè)。 1.5 腦組織含水量測(cè)定 待測(cè)含水量的腦組織標(biāo)本測(cè)定其濕質(zhì)量及在電熱 恒溫干燥箱中100 48h的干質(zhì)量，以計(jì)算含水量。公式如下:含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量× 100%。    1.6 腦組織中NMDAR1的表達(dá)情況 大鼠腦組織予多聚甲醛灌注、固定，完畢后斷頭取腦，腦組織采用4%多聚甲醛溶液再固定約24h，常規(guī)脫水石蠟包埋切片，厚度4m，取4張連續(xù)切片，操作步驟按SABC試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。步驟如下:切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2滅活內(nèi) 源性酶，熱修

8、復(fù)抗原，5%BSA封閉，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗體（1100）4過(guò)夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室溫保存20 min，SABC室溫20min，滴加新鮮配置的DAB顯色液進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片后，光鏡下觀察。應(yīng)用捷達(dá)801分析軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值，每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)高倍視野（400×）觀察并取其平均值，以灰度值來(lái)表示NR1的表達(dá)水平，灰度值越高，免疫組織化學(xué)染色越淺，NR1表達(dá)越低。 1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 x-±s 表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間均數(shù)之

9、間比較采用SNK檢驗(yàn)，相同時(shí)間點(diǎn)兩組間比較用 t 檢驗(yàn)，P <0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。        2 結(jié) 果 2.1 各組大鼠腦組織含水量 結(jié)果見(jiàn)表1。3組腦組織含水量在缺血再灌注后2、6h未見(jiàn)明顯區(qū)別，再灌注12h、1d時(shí)3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），模型組含水量明顯高于二氮嗪組和假手術(shù)組，二氮嗪組高于假手術(shù)組，2d時(shí)模 型組和假手術(shù)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P < 0.01），二氮嗪組和假手術(shù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3 d和7d 3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

10、異（P>0.05）。表1 3組大鼠缺血再灌注不同時(shí)間腦含水量比較（略）2.2 腦組織NR1的表達(dá) 模型組NR1在2h開(kāi)始升高，1d達(dá)到高峰后下降，7d達(dá)到正常水平。二氮嗪組變化與模型組類似，但NR1表達(dá)水平低于模型組，假手術(shù)組NR1表達(dá)水平最低，3組各時(shí)間點(diǎn)（除7 d外）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P <0.05）。3組灰度值見(jiàn)表2（灰度值越高，表明NR1表 達(dá)越低）。表2 各組再灌注后NR1的表達(dá)情況比較（略）            作者：陳鳳，莫緒明，顧群，彭衛(wèi)，何曉敏，

11、戚繼榮【摘】目的 探討二氮嗪對(duì)深低溫缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用及其         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。3 討 論 ATP依賴性鉀通道（KATP）屬于內(nèi)向整流型鉀通道，由完全不同的兩個(gè)亞單位構(gòu)成，即內(nèi)向整流亞單 位Kir 61x（Kir611和Kir612）和磺酰脲受體（SUR）兩種蛋白質(zhì)構(gòu)成2。KATP同時(shí)存在于細(xì)胞膜和線粒體膜上，是一種應(yīng)激活化分子

12、，缺氧、代謝毒物等均可將其激活，從而調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)外界刺激的適應(yīng)性。其中線 粒體ATP依賴性鉀通道（mito KATP）被認(rèn)為是組織缺血、缺氧保護(hù)的共同效應(yīng)器1 。mito KATP的開(kāi)放劑能有效地保護(hù)缺血再灌注損傷，是減輕缺血損傷和 介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)的主機(jī)制 3。mito KATP開(kāi)放劑二氮嗪原來(lái)僅被認(rèn)為是一種作用于血管內(nèi)膜鉀通道的血管擴(kuò)張劑，臨床上主用于治療高血壓。近年來(lái)mi- to KATP在腦缺血中的地位引起廣泛關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組腦組織含水量在12h及1d時(shí)間點(diǎn)明顯高于二氮嗪組和假手術(shù)組，而二氮嗪組高于假手術(shù)組，2d時(shí)腦含水量模型組高于假手術(shù)組，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <

13、0.01），二氮嗪組和假手術(shù)組間未見(jiàn)區(qū)別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)差別。這說(shuō)明了二氮嗪預(yù)處理對(duì)深低溫缺血再灌注大鼠具有腦保護(hù)作用。NR1是NMDAR的基本功能亞單位，NMDAR是 興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的離子型受體，生理狀態(tài)下， NMDAR的興奮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、學(xué)習(xí)、記憶起著關(guān)鍵作用，但是在缺血缺氧時(shí)，它卻是谷氨酸神經(jīng)毒性的主通路。谷氨酸是腦內(nèi)主的興奮性氨基酸，但是在一定條件下，也具有神經(jīng)毒性。缺血缺氧時(shí)谷氨酸通過(guò)直接和間接兩種途徑產(chǎn)生興奮毒性。目前已證實(shí)，缺血缺氧時(shí)谷氨酸的釋放增加，清除減少，突觸間 隙的谷氨酸濃度迅速升高，激活NMDAR，產(chǎn)生興奮毒性。高國(guó)棟等4研究發(fā)現(xiàn)，二氮嗪預(yù)處理

14、可抑制EAA的釋放，NMDA受體數(shù)量的增加可能反映著與受體結(jié)合的谷氨酸和（或）轉(zhuǎn)運(yùn)體量的增加。Selkirk等5研究報(bào)道谷氨酸的過(guò)多釋放和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育畸變有關(guān)，它可以使其受體過(guò)度激活并產(chǎn)生興奮性毒性，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的過(guò)度表達(dá)使小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞 的易損性增加。本試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了各組NR1的表達(dá) 水平，結(jié)果表明模型組NR1在2h開(kāi)始升高，1d達(dá)到高峰后下降，7 d達(dá)到正常水平。二氮嗪組變化與模型組類似，但NR1表達(dá)水平低于模型組，假手術(shù)組NR1表達(dá)水平最低，3組各時(shí)間點(diǎn)（除72h外）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。由此推斷，二氮嗪發(fā)揮腦保護(hù)作用 可能是通過(guò)下調(diào)NR1的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)

15、，這可能是其 腦保護(hù)作用機(jī)制之一。認(rèn)識(shí)到mitoKATP的存在已近10年，但有關(guān)檢測(cè)這種通道在完整細(xì)胞中活性的方法最近才發(fā)展起來(lái)。 越來(lái)越多的證據(jù)表明mitoKATP的藥理學(xué)特征是獨(dú)特的，然而這方面的研究進(jìn)展緩慢。最新研究表明，KATP通道在“缺血或缺氧預(yù)適應(yīng)”所誘導(dǎo)的大腦自身保護(hù)機(jī)制中起關(guān)鍵作用6-7。因此，KATP通道開(kāi)放劑作為腦保護(hù)劑將日趨成為研究熱點(diǎn)8-9。mitoKATP開(kāi)放劑二氮嗪預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠具有腦保護(hù)作用，是一種有潛力的腦保護(hù)藥物。明確其保護(hù)作用機(jī)制，可以為研制開(kāi)發(fā)新型抗腦缺血藥物及其二氮嗪應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【參考文獻(xiàn)】1 Dzeja P P，Holmuhame

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