病毒接種、收獲尿囊液操作步驟

1、病毒接種1. 選胚：首先，在照蛋間挑選出血管模糊，沒有生命跡象的雞胚。2. 標(biāo)記注射點(diǎn)：接著用記號筆在氣室上方約1mm處畫線，在線的下方挑選 注射點(diǎn)，在挑選注射點(diǎn)時應(yīng)注意避開主血管，避開雞頭。3.打孔：打孔前先用碘酊在氣室部位消毒，用打孔器在氣室線上方打孔。注意：孔不宜過大，否則會導(dǎo)致封蠟不完全，甚至將蠟油流進(jìn)雞胚內(nèi)部。 4.注射病毒：用注射槍向每個雞蛋孔內(nèi)注射0.2ml病毒稀釋液，注射時針頭朝向注射點(diǎn)方向，每次注射停留46s。5.封蠟：注射完畢，用鑷子夾取酒精棉沾上蠟油，進(jìn)行雞胚封蠟。6.培養(yǎng)：將封蠟完成的雞胚放入孵化箱中培養(yǎng)。孵化箱溫度設(shè)置3335，濕度50%70%，甲型流感病毒培養(yǎng)485

2、2小時，乙型流感病毒培養(yǎng)6672小時。需準(zhǔn)備的儀器試劑：手電筒，記號筆，碘酊，棉簽，量筒（稀釋），酒精燈，廢液瓶，打孔器，三腳架，蠟塊，連續(xù)注射器，一次性注射器，移液槍，移液槍槍頭，鑷子，紗布，打火機(jī)，藍(lán)蓋瓶。 注意事項：（1）、前一天將病毒原液拿至4冷庫；（2）、前一天準(zhǔn)備好需要滅菌消毒的物品，高溫高壓滅菌，烘干；確定好參加實(shí)驗(yàn)人數(shù)，準(zhǔn)備好無菌服；（3）、接種當(dāng)天早上將接種所需生物安全柜開紫外殺菌；收獲尿囊液1. 雞胚消毒: 將培養(yǎng)好的雞胚放入4冷庫進(jìn)行冷胚6h以上；首先，用0.1%的新潔而滅溶液將雞胚進(jìn)行消毒，每次消毒12分鐘。接著，在雞胚的氣室用碘酊消毒。2. 烙蛋：將經(jīng)過消毒處理的雞胚

3、在烙蛋器上進(jìn)行烙蛋。3. 收獲：先用小鑷子將殼膜撕破扒出氣室，再用大鑷子壓住雞頭，同時用5ml移液槍吸取尿囊液。收獲的尿囊液應(yīng)是澄清、微黃狀。4. 保存：將收獲的尿囊液放至6冷庫保存。需準(zhǔn)備的儀器試劑： 新潔而滅溶液，碘酊，棉簽，烙蛋器，廢液瓶，鑷子，5ml移液槍，5ml移液槍槍頭，藍(lán)蓋瓶（數(shù)量由病毒原液體積決定）。注意事項：（1）、前一天準(zhǔn)備好需要滅菌消毒的物品，高溫高壓滅菌，烘干；確定好參加實(shí)驗(yàn)人數(shù)，準(zhǔn)備好無菌服；（2）、收獲當(dāng)天早上將收獲所需生物安全柜開紫外殺菌；血凝滴度試驗(yàn)1. 稀釋病毒液：取一塊潔凈的“96”孔血凝板，橫向擺放。用微量移液器（20200ul）加入磷酸鹽緩沖液100ul

4、至第一孔，橫向從第二孔開始，每孔均用微量移液器（550ul）加入磷酸鹽緩沖液25ul直至第十二孔。2. 倍比稀釋：在“U”型96孔血凝板的左側(cè)標(biāo)記樣品名稱，用微量移液器（550ul）從第一孔內(nèi)加入25ul病毒懸浮液吹打混勻，將病毒液稀釋五倍。取出25ul放到第二孔中，從第二孔開始倍比稀釋，每孔吹打混勻，稀釋到最后一孔棄掉25ul，此時的稀釋倍數(shù)為1:10240。3. 陰性對照：在同一塊“U”型96孔血凝板的最后一排，后三孔用25ul的磷酸鹽緩沖液替代供試品，作為陰性對照。4. 加雞血：將1%雞紅細(xì)胞懸液倒入加樣槽吹打混勻，開始從第十二列至第一列每孔均用微量移液器（5-50l）加入25l的 1%

5、雞紅細(xì)胞懸液，振蕩均勻后置室溫40分鐘后觀察結(jié)果。5.結(jié)果計算：觀察陰性對照，若紅細(xì)胞于孔底形成一個小團(tuán)，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，可見紅細(xì)胞滑動呈淚滴狀為“”，則陰性對照成立。按照流感病毒血凝滴度檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程觀察每孔凝集狀態(tài)，結(jié)果以“+”（+以數(shù)字2代之）為終點(diǎn)，以紅細(xì)胞形成一個環(huán)狀，四周有小凝集塊者為“+”亦即一個凝集單位，也就是說最高稀釋度病毒能引起“+”號的紅細(xì)胞凝集為終點(diǎn)，此稀釋度的倒數(shù)為紅細(xì)胞凝集滴度簡稱血凝滴度。影響血凝抑制實(shí)驗(yàn)的因素1 .紅細(xì)胞懸液濃度：來源于不同個體雞的紅細(xì)胞，對抗原的敏感性不盡相同。因此實(shí)驗(yàn)時最好用3-4只未免疫雞。配制紅細(xì)胞時，紅細(xì)胞

6、濃度低，HI滴度就會下降；紅細(xì)胞濃度高，HI滴度就會上升。有實(shí)驗(yàn)表明，紅細(xì)胞濃度增加一倍，HI滴度就會上升20.7-0.9，因此，紅細(xì)胞濃度以1為宜。 2 .抗原的稀釋倍數(shù)：配制抗原時，濃度必須準(zhǔn)確。當(dāng)抗原濃度高時，(HI)抗體效價就下降；當(dāng)抗原濃度抵時，(HI)抗體效價就上升。 3 .實(shí) 驗(yàn) 用 的 稀 釋 液（PBS）： 稀釋液的pH值對實(shí)驗(yàn)有影響。稀釋液的pH值5.8以下，紅細(xì)胞容易產(chǎn)生自凝現(xiàn)象；pH值在7.8以上凝集圖形易消失，也會造成實(shí)驗(yàn)誤差。而pH值為7.0時，紅細(xì)胞沉降最充分，圖形最清晰，HI效價也最高，因此實(shí)驗(yàn)時用ph7.0-7.2的稀釋液。 4 .實(shí)驗(yàn)時的溫度： 實(shí)驗(yàn)時的溫度，從4-37，隨著溫度上升，HA與HI滴度提高，但在37時，凝集的紅細(xì)胞易洗脫；4以下紅細(xì)胞易產(chǎn)生自凝，故操作常用18-22。  （以上所闡述的是實(shí)驗(yàn)室操作過程中存在的幾點(diǎn)因素，在實(shí)際工作中，也存在著其他諸多原因，如采樣的時間、采樣的數(shù)量、以及由疫苗產(chǎn)生的影響等。) 流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)工藝流程相關(guān)參數(shù)工藝流程相關(guān)參數(shù)接種注射0.2ml/枚收獲收獲810ml/枚離心澄清10000rpm，1020min平板過濾0.45um超濾濃縮300KD蔗糖密度梯