免疫標(biāo)記技術(shù)

1、免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫標(biāo)記技術(shù)指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)；并藉助于熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定。 免疫標(biāo)記技術(shù)可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過一般免疫血清學(xué)方法。 常用的幾種免疫標(biāo)記技術(shù)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)放射免疫標(biāo)記技術(shù)

2、酶標(biāo)記技術(shù)膠體金標(biāo)記技術(shù)生物素和親和素標(biāo)記技術(shù)發(fā)光免疫標(biāo)記技術(shù)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)基本原理： 免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體(或抗原)結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。在實(shí)際工作中，由于用熒光素標(biāo)記抗體檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱為熒光抗體技術(shù)。 熒光熒光是指一個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素?zé)晒馑厥且环N能吸收激發(fā)光的光能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使

3、用的有機(jī)化合物。目前用于標(biāo)記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。 熒光效率熒光效率熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于最大發(fā)射光

4、波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也最大。 熒光抗體染色方法熒光抗體染色方法 ：A.直接法：這是熒光抗體技術(shù)最簡(jiǎn)單和基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標(biāo)本片上，經(jīng)反應(yīng)和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。標(biāo)本中如有相應(yīng)抗原存在，即與熒光抗體特異結(jié)合，在鏡下可見有熒光的抗原抗體復(fù)合物。此法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、特異。但其缺點(diǎn)是檢查每種抗原均需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法B.間接法：用熒光素標(biāo)記二抗。檢測(cè)過程分為兩步：第一次，將待測(cè)一抗加在含有已知抗原的標(biāo)本片上作用一定時(shí)間，洗去未結(jié)合的抗體。第二，滴加標(biāo)記二抗。如果第一步中的抗原抗體已發(fā)生結(jié)合，此時(shí)加入的標(biāo)記二抗就和已固定在抗原上的一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-標(biāo)記抗

5、抗體復(fù)合物，并顯示特異熒光。此法的優(yōu)點(diǎn)是敏感性高于直接法，且無需制備每一種熒光素標(biāo)記的特異抗體，就可用于檢測(cè)同種動(dòng)物的多種抗原抗體系統(tǒng)。間接法的缺點(diǎn)是有時(shí)易產(chǎn)生非特異性熒光。直接免疫熒光法原理示意圖 間接免疫熒光法原理示意圖 放射免疫標(biāo)記技術(shù)基本原理： 放射免疫標(biāo)記技術(shù)是將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。 由于放射免疫標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高(可檢測(cè)出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物質(zhì)，特異性強(qiáng)(可分辨結(jié)構(gòu)類似的抗原)、重復(fù)性強(qiáng)、樣品及試劑用量少測(cè)定方法易規(guī)范化和自動(dòng)化等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。因此、在醫(yī)學(xué)及其他生物學(xué)科

6、的研究領(lǐng)域和臨床實(shí)驗(yàn)診斷中廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標(biāo)志物等的分析與定量測(cè)定。缺點(diǎn)是試劑使用期限短，存在放射性污染 。目前常用的同位素是125I A.放射免疫測(cè)定(Radio immunoassay，RIA)標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原對(duì)有限量抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)。 B.免疫放射測(cè)定 (IRMA)待測(cè)抗原與過量標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)綜合反應(yīng)。C.放射受體分析(RRA)與免疫放射測(cè)定相似。應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記配體，在一定條件下與相應(yīng)受體結(jié)合成配體-受體復(fù)合物。 酶免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫酶技術(shù)就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既

7、不改變抗體成抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)加以測(cè)定。這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。 酶是一種有機(jī)催化劑，很少量的酶即可導(dǎo)致大量的催化過程，所以極為敏感。它的催化過程有兩種基本形式：(1)E十S (ES)E十P(2)E十S (ES)(ES)十D1 E十P十D2E為酶，S為酶作用的底物，P為底物分解后的產(chǎn)物，D，為供氫體，D：為D1的氧

8、化型。如P或D：為有色化合物，即可用呈色反應(yīng)顯示酶的存在。 常用的酶及其底物 酶 底物顯色反應(yīng) 測(cè)定波長(zhǎng)辣根過氧化物酶 (HRP)鄰苯二胺 (OPD)四甲替聯(lián)苯胺 (TMB)5氨基水楊酸 (5AS)鄰聯(lián)苯甲胺 (OT)2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 (ABTS )3.3二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 橙紅色 藍(lán)綠色 棕色 藍(lán)綠色 藍(lán)綠色 棕色不溶 性沉淀492 450 449425 642堿性磷酸酯 酶 (AP)4-硝基酚磷酸鹽(PNP) 黃色405BCIP/NBT黑紫色沉淀萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 紅色500葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 黃色405 420葡萄

9、糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 深藍(lán)-半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)螢光360 450硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黃色420辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH39,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm HRP對(duì)氫受體的專一性很高，

10、僅作用于H2O2 、小分子醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（28）可穩(wěn)定1年。 HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下: HRP DH2H2O2D2H2O 供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾

11、用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。 目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為橙紅色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好，ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低。尤其是在致癌

12、的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。HRP標(biāo)記抗體的方法 A.戊二醛法B.過碘酸鹽氧化法 膠體金標(biāo)記技術(shù) 膠體金標(biāo)記技術(shù) (Immunogold labeling technique) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。利用它在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)藉靜電吸引而形成牢固結(jié)合，除抗體蛋白外，膠體金還可與其他多種生物大分子結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理特性，如高電子密度、顆粒大小

13、、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物所具有的免疫-生物學(xué)特性，使其在免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記研究工作中得到廣泛應(yīng)用。膠體金標(biāo)記技術(shù) 生物素與親合素標(biāo)記技術(shù) 生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。BAS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的各個(gè)領(lǐng)域，既可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測(cè)及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應(yīng)體系中

14、反應(yīng)物的分離、純化。 親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達(dá)1015M-1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價(jià)鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級(jí)放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)的催化作用而呈色，達(dá)到檢測(cè)未知抗原(或抗體)分子的目的。 BASBAS用于檢測(cè)的基本方法 A.標(biāo)記親和素連接生物化大分子反應(yīng)體系，稱BA法 B.以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素，稱為BAB法 C.將親和素與酶標(biāo)生物素共溫形成親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，再與生物

15、素化的抗抗體接觸時(shí)，將抗原-抗體反應(yīng)體系與ABC標(biāo)記體系連成一體，稱為ABC法。 發(fā)光免疫標(biāo)記技術(shù) 發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新型超微量分析技術(shù)。這種方法兼具有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。 A.化學(xué)發(fā)光是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)。當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)的最低振功能級(jí)回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)時(shí)產(chǎn)生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。 B.生物發(fā)光是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如熒火蟲的發(fā)光。以往化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光看作是彼此獨(dú)立的過程，隨

16、著這一領(lǐng)域研究的深人，逐漸加深了對(duì)各種生物發(fā)光反應(yīng)機(jī)理的認(rèn)識(shí)。實(shí)際上，生物體內(nèi)的各種發(fā)光現(xiàn)象都與化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，實(shí)際上生物發(fā)光是發(fā)生在生物體內(nèi)的一種化學(xué)發(fā)光。 發(fā)光免疫分析的類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析:以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，直接引發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析:用參與某些發(fā)光反應(yīng)的酶來標(biāo)記抗原或抗體。免疫反應(yīng)后，加入發(fā)光試劑，測(cè)定發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行抗原或抗體測(cè)定。 生物發(fā)光免疫分析:利用生物發(fā)光物質(zhì)或參與生物發(fā)光反應(yīng)的輔助因子標(biāo)記抗原或抗體。免疫反應(yīng)后，運(yùn)用生物發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。 免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（ECL Reagent） 基本原理: 辣根過氧化酶使試劑中的發(fā)光物（Luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)