HPLC法測定甲磺酸培氟沙星片含量及有關(guān)物質(zhì)

1、    HPLC法測定甲磺酸培氟沙星片含量及有關(guān)物質(zhì)作者：李緒倫，李霞，曾杰，劉映倩【摘要】  目的：建立高效液相色譜法測定甲磺酸培氟沙星片中藥物及有關(guān)物質(zhì)。方法：色譜柱為C18柱（150 mm×6 mm，5 m），流動相為乙腈2.70 g/L十六烷基三甲基溴化氨與6.18 g/L硼酸溶液的混合溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液準確調(diào)pH至8.30）硫二甘醇（30700.2），檢測波長為273 nm。結(jié)果：甲磺酸培氟沙星在 17.1885.90 g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r= 0.999 9），其平均回收率為9

2、9.50%、99.71%、99.62%，最低檢測限和定量限分別為 0.01989 ng和0.08517 ng，與雜質(zhì)及喹諾酮類同系物能有效分離。結(jié)論：本方法操作簡便、結(jié)果準確、專屬性強，可用于甲磺酸培氟沙星片中藥物含量及有關(guān)物質(zhì)的檢測。 【關(guān)鍵詞】  甲磺酸培氟沙星；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)AbstractObjective:To establish a method for the assay of pefloxacin mesilate tablets and its related substance by HPLC. Methods: The analysis wa

3、s conducted by HPLC using a C18 (150 mm×6 mm, 5 m) column. The mobile phase was acetonitrilemixture of 2.70 g/L cetyltrimethylammonium bromide with 6.18 g/L boric acid solution (adjusted to pH 8.30 with 1 mol/L sodium hydroxide)2,2thiodiglycol (30700.2). The detection wavelength was set at 273

4、nm. Results: The precision and stability were fine. The linear correlation of pefloxacin mesilate tablets was observed within the range of 17.1885.90 g/mL (r=0.9999). The average recoveries were 99.50%, 99.71% and 99.62%. The limit of detection and quantification was 0.01989 ng and 0.08517 ng respec

5、tively. The resolution between the respective peaks of pefloxacin mesilate with the other peaks conformed to the requirements. Conclusions: The method is simple, accurate and specific, and reproducible for the assay of pefloxacin mesilate tablets and its related substance.Key wordsPefloxacin mesilat

6、e; High performance liquid chromatograph; Related substance甲磺酸培氟沙星是第三代喹諾酮類抗菌藥物，主要作用于細菌細胞的DNA回旋酶，干擾細菌DNA的合成，使細菌死亡。對泌尿生殖系統(tǒng)感染、胃腸道感染、傷寒、皮膚軟組織感染具有很好的 治療 效果。 中國 藥典2005年版二部收載該品種，采用HPLC法進行有關(guān)物質(zhì)及含量控制1。但我們在進行方法學考察時發(fā)現(xiàn)，其色譜系統(tǒng)不能將其與其前體原料藥諾氟沙星有效分離，故本文參照EP6.2（歐洲藥典6.2版）2重新建立了甲磺酸培氟沙星及有關(guān)物質(zhì)含量的HPLC分析方法。 1 儀器與試藥 1.1 儀器Agil

7、ent1100高效液相色譜儀（四元泵，自動進樣器，紫外檢測器和DAD檢測器）。1.2 試藥與試劑甲磺酸培氟沙星片（規(guī)格：0.2 g，批號：070503、070701、070702，宜昌人福藥業(yè)有限責任公司提供；規(guī)格：0.2 g，批號：070901、070902、070903，山西太原藥業(yè)有限公司提供；規(guī)格：0.2 g，批號：070801、070802、070803，湖北科益藥業(yè)股份有限公司提供；規(guī)格：0.1 g，批號：071102，規(guī)格：0.2 g，批號：071101、080102，內(nèi)蒙古通遼制藥有限公司提供）；甲磺酸培氟沙星對照品（批號：130459200301，含培氟沙星71.1%，由中國

8、藥品生物制品檢定所提供）；乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，純化水自制；硫二甘醇為進口試劑，Alfa Aesar產(chǎn)品。 2 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.60 mm，5 m，適宜范圍：pH 112）；Phenomenex Luna C18（250 mm×4.60 mm，5 m，適宜范圍：pH 1.510.0），SHISEIDO MG C18（4.6 mm×250 mm，5 m，適宜范圍：pH 210）；流動相：乙腈2.70 g/L十六烷基三甲基溴化氨與6.18 g/L硼酸溶液的混合溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液

9、準確調(diào)pH至8.30）硫二甘醇（30700.2）；檢測波長273 nm；流速：1.0 ml/L；柱溫為30 ；進樣量：20 L。 3 方法學考察 3.1 專屬性試驗3.1.1 強降解破壞試驗取本品適量，加流動相溶解成4 mg/mL的溶液，量取10 mL共3份，置25 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液5 mL、1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL、10過氧化氫溶液0.2 mL，室溫放置4 h后，分別加酸或堿中和，加流動相稀釋至刻度，濾過，作為上述破壞的供試品溶液。另取本品適量，加流動相溶解成4 mg/mL的溶液，量取10 mL共3份，分別置80 水浴放置4 h、4 000 lx光照48

10、h、紫外光照射24 h，加流動相稀釋至25 mL，取上述6種溶液各20 L進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示供試品溶液對酸、堿、熱均較穩(wěn)定，對氧和光穩(wěn)定性較差，特別是紫外光照射對其穩(wěn)定性影響較大。各種破壞產(chǎn)物除酸破壞在主峰后產(chǎn)生一雜質(zhì)峰外，其余破壞產(chǎn)物均在主峰之前出峰。所產(chǎn)生的雜質(zhì)峰均與主峰有良好的分離度，表明本方法有良好的專屬性。結(jié)果見圖1。3.1.2 喹諾酮類同系物的分離試驗以諾氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、司帕沙星、氟羅沙星、洛美沙星、吡哌酸、加替沙星為對照，考察這些物質(zhì)與培氟沙星峰的分離情況。結(jié)果培氟沙星與上述同系物均能有效分離，詳見圖2。3.1.3 峰純度檢查將各破壞的樣品溶液用

11、二極管陣列檢測器進行了純度檢測，結(jié)果其主峰純度均大于990，符合要求。3.2 線性實驗取培氟沙星對照品溶液，按前面確定的色譜條件進樣，以峰面積A對濃度C進行回歸，求得的回歸方程為A62117.7C-8.0480，r0.9999，培氟沙星在17.1885.90 g/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。3.3 精密度試驗取培氟沙星對照品適量，加水溶解并定量稀釋成每毫升含培氟沙星20 g的溶液，按前面確定的色譜條件測定峰面積，連續(xù)進樣6次，結(jié)果RSD=0.15%，表明此方法精密度良好。3.4 回收率試驗取三個處方差異較大的生產(chǎn)廠家的樣品（宜昌人福、湖北科益、山西太原），采用對照品加樣品進行回收率試驗。分別配制

12、三個濃度的供試品溶液各三份（分別相當于測定濃度的80%、100%和120%），測定其含量，將實測值與理論值比較， 計算 回收率，并計算9個回收率數(shù)據(jù)的相對標準差（RSD）。結(jié)果3個生產(chǎn)廠家3種處方工藝的樣品平均回收率分別為99.50%、99.71%、99.62%，RSD分別為0.80%、0.99%、0.41%，結(jié)果顯示方法準確可行。3.5 溶液的穩(wěn)定性考察本品在水中和流動相中均溶解良好，故對樣品在兩種溶液中的穩(wěn)定性均進行了考察，分別采用水和流動相溶解樣品，室溫放置0、2、4、6、8、10 h后取樣，照上述色譜條件進行峰面積測定，計算RSD。結(jié)果在水溶液和流動相中RSD分別為0.23%和0.30

13、%，柱效分別為9 476和10 632。表明本品在水溶液和流動相溶液中室溫放置10 h均穩(wěn)定。3.6 檢測限及定量限取培氟沙星對照品溶液進行稀釋，按上述確定的色譜條件進樣，測得培氟沙星檢測限為0.01989 ng（以信噪比為3計），定量限為0.08517 ng（以信噪比為10計）。 4 有關(guān)物質(zhì)及含量測定 分別配制4個廠家各3個批號的供試品溶液，按前述色譜條件進行有關(guān)物質(zhì)及含量檢測，結(jié)果雜質(zhì)峰出峰時間均在主峰前，雜質(zhì)及培氟沙星的含量結(jié)果見表1。表1 有關(guān)物質(zhì)及含量測定結(jié)果（略） 5 討論 甲磺酸培氟沙星合成工藝一般由諾氟沙星與甲醛、甲酸進行甲基化反應生成甲基物（培氟沙星），再與甲磺酸在乙醇溶液

14、中進行成鹽反應生成甲磺酸培氟沙星，因此甲磺酸培氟沙星中主要的雜質(zhì)為其原料諾氟沙星。如果用 中國 藥典2005版1流動相系統(tǒng)，水相的pH值為2.5，諾氟沙星與培氟沙星峰在同一位置出峰，不能分離，而采用本文試驗條件所述流動相系統(tǒng)，水相pH值為8.3，諾氟沙星峰與培氟沙星峰能有效分離（分離度15.32）。以培氟沙星為主峰，諾氟沙星相對出峰時間為0.4，在此相對保留時間處，強破壞試驗中檢出相應雜質(zhì)峰。采用實驗條件所述流動相系統(tǒng)，其有機相比例的減少對培氟沙星與氧氟沙星的分離度影響較大，有機相增加5%，培氟沙星與氧氟沙星的分離度僅為1.17，不能達到基線分離；pH（±0.2）與流速（±

15、20）的細微變化，不影響各峰的峰形、出峰順序以及分離情況。不同的色譜柱對紫外及氧化破壞的樣品進行了檢測，結(jié)果出峰時間稍有差異，但主峰與雜質(zhì)峰分離效果均良好，圖譜能較好地重現(xiàn)。甲磺酸培氟沙星在波長277 nm和273 nm，峰的響應值沒有大的差別，在258 nm波長處，峰的響應值較低，大約為上面兩個波長的1/4，經(jīng)紫外掃描，最大吸收在273 nm處，258 nm為其波谷，各輔料在273 nm波長處幾乎無吸收；同時EP6.22上收載的質(zhì)量標準中，258 nm波長處主要檢測培氟沙星主峰以后出峰的雜質(zhì)，而經(jīng)前面的破壞試驗可知，采用EP6.2流動相系統(tǒng)只有酸破壞樣品在主峰后檢出一雜質(zhì)，而其余強破壞樣品均未檢出雜質(zhì)峰。另外考慮到含量測定方法和有關(guān)物質(zhì)檢測方法的一致性，以便于方法的簡便